Summary
En mikroflödessystem holme perifusion enhet har utvecklats för bedömning av dynamiska insulinsekretionen av flera holmar och samtidiga fluorescens avbildning av kalciuminflödet och mitokondrie eventuella förändringar.
Abstract
En mikroflödessystem holme perifusion enhet har utvecklats för bedömning av dynamiska insulinsekretionen av flera holmar och samtidiga fluorescens avbildning av kalciuminflödet och mitokondrie eventuella förändringar. Enheten består av tre lager: för det första lagret innehåller en rad mikroskala brunnar (500 ìm diameter och 150 ìm djup) som bidrar till att immobilisera kobbar och samtidigt utsätts för flödet och maximera den exponerade ytan av holmar, den andra lagret innehåller en cirkulär perifusion kammare (3 mm djup, 7 mm i diameter) och den tredje lagret innehåller en vik-blandning kanal som fans innan injektion i perifusion kammare (2 mm bred, 19 mm i längd och 500 mikrometer i höjd) för att optimera blandning effektivitet före inträde i perifusion kammaren. Skapandet av olika glukos gradienter, inklusive en linjär, klocka form och kvadratiska former kan också skapas i mikroflödessystem perifusion nätverket och demonstreras.
Protocol
A. mikrofabrikation av 3-lagers mikroflödessystem perifusion enhet
Botten Väl Mästare Protocol (150 ìm djupa brunnar)
- Rengör skivan med ett rakblad om det behövs. Rengör med aceton, metanol, och IPA. Utför plasma behandling med 50 watt för 30 s.
- Spin SU8-100 @ 2000 rpm. [Steg 1: 500 rpm, 10 s, 100 varv / s, Steg 2: 2000 rpm, 30 s, 300 varv / s].
[OBS! Inte håller skivan med pincett efter spinning SU8] - Mjuk baka rånet vid 65 ° C i 20 minuter och vid 95 ° C i 50 min.
- Skivan utsätts för UV-ljus genom en önskad mask. Dos för 150 ìm höjd är 650 mJ / cm 2.
- Efter exponering baka rånet vid 65 ° C i 1 min och vid 95 ° C i 12 min.
- Utveckla rånet i SU8 utvecklare för 15 min.
Mikrokanalplattor Mästare Protokoll (500 ìm djupa brunnar)
- Rengör skivan med ett rakblad om det behövs. Rengör med aceton, metanol, och IPA. Utför plasma behandling med 50 watt för 30 s.
- Spin SU8-2150 @ 1000 rpm. [Steg 1: 500 rpm, 10 s, 100 varv / s, Steg 2: 1000 rpm, 30 s, 300 varv / s].
- Mjuk baka rånet vid 65 ° C i 15 min och vid 95 ° C i 2 timmar och 30 min.
- Skivan utsätts för UV-ljus genom en önskad mask. Exponering dos för 650 ìm höjd är 685 mJ / cm 2.
- Efter exponering baka rånet vid 65 ° C i 5 min och vid 95 ° C i 35 min.
- Utveckla rånet i SU8 utvecklare för 20-30 min.
PDMS beredning av lösningar
- Polydimetylsiloxan (PDMS) lösning bereds genom att noga blanda 10 delar av silikon elastomer med en del av härdare av en standard Sylgard 184 kit.
- De bubblor som genereras i PDMS lösning under blandningsprocessen tas bort med hjälp av en vakuumexsickator.
- Den bubbelfritt PDMS lösning är långsamt dispenseras på SU8 mästare och en tom petriskål för det tredje lagret.
- Temperaturen på den varma plattan är satt till 75 ° C och PDMS är botad vid denna temperatur i 2 timmar
- Inlopp, utlopp och brunnar utbyte stansas ut med hjälp av lämpliga hålslag storlek hål.
- Lagren är bundna tillsammans på en glasplatta (storlek 0,1 mm) med hjälp av en handhållen plasma enhet.
B. experimentuppställning
- Flow 70% etanol genom mikro-enheten för att sterilisera. Flöde DI-vatten för att tvätta ur etanolen. BEGJUTA 50 ml 0,5% BSA genom enheten för att förhindra icke specifik adsorption av insulin till mikrokanalplatta väggarna.
- Glukos ramp lutning och andra relaterade gradienter som genereras av LabView programvara som kommunicerar med sprutan pumpar testas för att säkerställa att lutningar är stabila.
- 25-30 möss holmar inkuberades med 5 mikroM Fura-2/AM (en kalcium indikator, molekylära sonder, CA) och 2,5 mikroM Rhodamine 123 (Rh123, en mitokondriell potentialer indikator, Sigma, MO) i 30 min vid 37 ° C i Krebs-Ringer buffert (KRB) innehållande 2 mM glukos
- Mössen holmar är noggrant pipetteras till mikroflödessystem perifusion enhet genom inloppet.
- Den mikroflödessystem nätet sedan installationen genom att ansluta inloppet till sprutan pumpar med Tygon slang och en Y-koppling och utlopp till Fraktionssamlare. Enheten sitter på en uppvärmning scenen (37 ° C) på mikroskopet och inloppsslang värms på en värmeplatta för att hålla temperaturen på kammaren och lösningen vid 37 ° C.
- Omedelbart efter installationen, är de möss holmar perifused med KRB med 2 mM glukos i 10 min och sedan en glukos ramp (2mm 25mm) för 25 min.
- Time-lapse bilder samlas in och analyseras var 15: s av SimplePCI programvara. Den perifusate samlas också in varje minut med en bråkdel samlare för att analysera insulinutsöndring med ELISA-kit.
Representativa resultat
Mus holmar var perifused med en linjär lutning 2-25 mM glukos. Som visas i figur 1, är kalciuminflödet och insulinutsöndring utlöses efter ca 13 minuter perifusion, motsvarande 6 mM glukos. Förändringar i Mitokondriell potentialer är sett tidigare som förväntat, ca 11 minuter. Dessa data visar på fördelen med att använda denna mikrofabricerade nätverk för att karakterisera holme fysiologi.
Figur 1. Fysiologiska reaktioner på holmen cell stimulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Traditionella holme perifusion system (makroskala och mikroskala) har vissa begränsningar, inklusive komplex av installation och design, höga tekniska krav och svårigheter att skapa användardefinierade föreskrivna kemiska gradienter i systemet. Den mikroflödessystem perifusion som beskrivs här övervinner dessa begränsningar med enkla geometrin för design och tillverkning. Viktigare, kan detta system integreras med fluorescens avbildningsteknik som ger ett unikt verktyg för att studera holme fysiologi. Systemet visade med högt signal-brusförhållande och spatial-temporala upplösningen i dessa fluorescens signaler. Den nuvarande prototyp enheten kan också hålla flera perifusion uppställningar i ett chip och ge olika typer av mikromiljöer för utbredd tillämpning ändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av AAUW internationella gemenskapen att Adeola Adewola, NIH / NCRR (U42RR023245) till Jose Oberholzer, och Chicago Diabetes Project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60ml Syringes | BD Biosciences | ||
| Fura-2 fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine123 Fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30" Silicone tubings | Cole-Parmer | 1/16 x 1/8in | |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16” & 4mm | |
| Syringe connectors | Cole-Parmer | female luer plug 1/16” | |
| Straight connectors | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Elbow connector | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Havard syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Perifusion device | |||
| Hot plate | PMC | ||
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Fraction collector | Gibson | ||
| Pippettor | Fisher Scientific | ||
| Inverted epiflorescence microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Charge-coupled device | QImaging | Retiga-SRV, Fast 1394 |
References
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
