Summary
Um dispositivo perifusion microfluídicos ilhota foi desenvolvido para a avaliação dinâmica da secreção de insulina de ilhotas múltiplo e imagens de fluorescência simultânea de influxo de cálcio e mitocondrial possíveis mudanças.
Abstract
Um dispositivo perifusion microfluídicos ilhota foi desenvolvido para a avaliação dinâmica da secreção de insulina de ilhotas múltiplo e imagens de fluorescência simultânea de influxo de cálcio e mitocondrial possíveis mudanças. O dispositivo consiste de três camadas: a primeira camada contém uma matriz de microescala poços (500 mm e diâmetro de 150 profundidade mm) que ajudam a imobilizar o ilhotas enquanto expostos a fluxo e maximizar a área de superfície exposta das ilhotas, a segunda camada contém uma circular perifusion câmara (3 mm de profundidade, 7 mm de diâmetro), ea terceira camada contém um canal de entrada de mistura que os fãs antes de injeção na câmara perifusion (2 mm de largura, 19 mm de comprimento e 500 mm de altura) para otimizar a eficiência de mistura antes de entrar na câmara de perifusion. A criação de gradientes de glucose diversos, incluindo uma linear forma de sino, e formas quadradas também podem ser criados na rede perifusion microfluídicos e é demonstrada.
Protocol
A. Microfabricação de 3 camadas dispositivo perifusion microfluídicos
Bem fundo Mestre Protocol (150 mM poços profundos)
- Limpe o wafer usando uma lâmina de barbear, se necessário. Limpe com acetona, metanol, e IPA. Realizar o tratamento de plasma de 50 Watts por 30 s.
- Spin-SU8-100 @ 2000 rpm. [Passo 1: 500 rpm, 10 s, 100 Passo rpm / s, 2: 2000 rpm, 30 s, a 300 rpm / s].
[NOTA: Não segure o wafer com uma pinça, após girar SU8] - Bake mole do wafer a 65 ° C por 20 min e aos 95 ° C por 50 min.
- O wafer é exposto à luz UV através de uma máscara desejada. Dose para 150 M de altura é de 650 mJ / cm 2.
- Pós-exposição assar o wafer de 65 ° C por 1 min e em 95 ° C por 12 min.
- Desenvolver o wafer em SU8 desenvolvedor por 15 min.
Microcanais Mestre Protocol (500 mm poços profundos)
- Limpe o wafer usando uma lâmina de barbear, se necessário. Limpe com acetona, metanol, e IPA. Realizar o tratamento de plasma de 50 Watts por 30 s.
- Spin-SU8-2150 @ 1000 rpm. [Passo 1: 500 rpm, 10 s, 100 Passo rpm / s, 2: 1000 rpm, 30 s, a 300 rpm / s].
- Bake mole do wafer a 65 ° C por 15 min e aos 95 ° C durante 2 horas e 30 min.
- O wafer é exposto à luz UV através de uma máscara desejada. Dose de exposição para 650 M de altura é de 685 mJ / cm 2.
- Pós-exposição assar o wafer de 65 ° C por 5 min e em 95 ° C por 35 min.
- Desenvolver o wafer em SU8 desenvolvedor por 20-30 min.
PDMS preparação da solução
- Polidimetilsiloxano solução (PDMS) é preparado através de uma profunda mistura de 10 partes de elastômero de silicone com 1 parte de agente de cura de um kit Sylgard padrão 184.
- As bolhas geradas na solução PDMS durante o processo de mistura são removidas usando um exsicador de vácuo.
- A bolha sem solução PDMS é lentamente dispensada na SU8 mestres e uma placa de Petri vazia para a terceira camada.
- A temperatura da placa quente é definido como 75 ° C ea PDMS é curado a esta temperatura durante 2 horas
- Entradas, saídas e poços de câmbio são socou para fora usando o furador de tamanho apropriado.
- As camadas são unidas em uma lâmina de vidro (mm tamanho 0.1) usando um dispositivo handheld plasma.
B. configuração Experimental
- Fluxo de etanol 70% através do dispositivo de micro-para esterilizar. DI fluxo de água para lavar o etanol. Perfundir 50 ml de BSA 0,5% através do dispositivo para evitar adsorção não específica de insulina para as paredes de microcanais.
- O gradiente de rampa de glicose e outros relacionados com gradientes gerados pelo software LabView que se comunica com a seringa bombas são testadas para garantir que a gradientes são estáveis.
- 25-30 ilhotas ratos foram incubados com 5 Fura-2/AM M (um indicador de cálcio, sondas moleculares, CA) e 2,5 mM Rodamina 123 (Rh123, um indicador de potencial mitocondrial, Sigma, MO) por 30 min a 37 ° C em Krebs-Ringer buffer (KRB) contendo 2 mM de glicose
- As ilhotas ratos são cuidadosamente pipetados dispositivo perifusion microfluídicos através da porta de entrada.
- A rede de microfluídica é, então, configuração, ligando à entrada das bombas de seringa usando tubos Tygon e um conector Y ea saída para coletor de fração. O dispositivo fica em um estágio de aquecimento (37 ° C) no microscópio e do tubo de admissão é aquecida numa placa de aquecimento para manter a temperatura da câmara e uma solução a 37 ° C.
- Imediatamente após a instalação, as ilhotas ratos são perifused com KRB contendo 2 mM de glicose por 10 min e, em seguida uma rampa de glicose (2mM 25mM) por 25 min.
- Lapso de tempo imagens são coletadas e analisadas a cada 15 s por software SimplePCI. O perifusate também é coletado a cada minuto através de um coletor de frações para analisar a secreção de insulina utilizando ELISA kit.
Resultados representante
Ilhotas de rato foram perifused com um gradiente linear de 2-25 mM de glicose. Conforme mostrado na Figura 1, o influxo de cálcio e secreção de insulina são desencadeados após cerca de 13 minutos de perifusion, correspondendo a 6 mM de glicose. Mudanças no potencial mitocondrial são vistos anteriormente como esperado, em cerca de 11 minutos. Estes dados demonstram a vantagem de usar esta rede microfluídicos para caracterizar ilhota fisiologia.
Figura 1. Respostas fisiológicas de estimulação das células da ilhota.
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Discussion
Sistemas tradicionais de ilhotas perifusion (macroescala e microescala) tem algumas limitações, incluindo complexo de configuração e design, alta requisitos técnicos, e dificuldade para criar gradientes usuário prescritos química no sistema. O sistema perifusion microfluídicos descritas aqui supera estas limitações com geometria simples de projeto e fabricação. Mais importante, este sistema pode ser integrado com abordagem imagens de fluorescência que fornecem como uma ferramenta única para estudar a fisiologia das ilhotas. O sistema demonstrado com relação sinal-ruído alta e espacial-temporal resolução dos sinais de fluorescência. O protótipo atual também pode armazenar setups perifusion múltiplas em um único chip e fornecer diferentes tipos de microambientes para fins de aplicação generalizada.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela AAUW companheirismo internacional para Adeola Adewola, NIH / NCRR (U42RR023245) para Jose Oberholzer, e O Projeto Diabetes Chicago.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60ml Syringes | BD Biosciences | ||
| Fura-2 fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine123 Fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30" Silicone tubings | Cole-Parmer | 1/16 x 1/8in | |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16” & 4mm | |
| Syringe connectors | Cole-Parmer | female luer plug 1/16” | |
| Straight connectors | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Elbow connector | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Havard syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Perifusion device | |||
| Hot plate | PMC | ||
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Fraction collector | Gibson | ||
| Pippettor | Fisher Scientific | ||
| Inverted epiflorescence microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Charge-coupled device | QImaging | Retiga-SRV, Fast 1394 |
References
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
