Summary
Un dispositivo de microfluidos perifusion islote fue desarrollado para la evaluación de la dinámica de la secreción de insulina de los islotes y varias imágenes simultáneas de fluorescencia de la entrada de calcio mitocondrial y los posibles cambios.
Abstract
Un dispositivo de microfluidos perifusion islote fue desarrollado para la evaluación de la dinámica de la secreción de insulina de los islotes y varias imágenes simultáneas de fluorescencia de la entrada de calcio mitocondrial y los posibles cambios. El dispositivo consta de tres capas: la primera capa contiene una matriz de micro pozos (500 m de diámetro y 150 m de profundidad) que ayudan a inmovilizar a los islotes durante la exposición al flujo y maximizar la superficie expuesta de los islotes, la segunda capa contiene una circular perifusion cámara (3 mm de profundidad, 7 mm de diámetro), y la tercera capa contiene un canal de entrada de mezcla que los aficionados a cabo antes de la inyección en la cámara de perifusion (2 mm de ancho, 19 mm de longitud y 500 m de altura) para la optimización de la eficiencia en la mezcla antes de entrar en la cámara de perifusion. La creación de los gradientes de la glucosa, asimismo, de una forma lineal, campana, y las formas cuadradas también se pueden crear en la red perifusion de microfluidos y se ha demostrado.
Protocol
A. microfabricación de dispositivos de 3 capas perifusion microfluidos
Fondo del pozo de protocolo maestro (150 micras pozos profundos)
- Limpie la oblea con una cuchilla de afeitar, si es necesario. Limpie con acetona, metanol, y el IPA. Realizar el tratamiento de plasma de 50 vatios durante 30 s.
- Giro SU8-100 @ 2000 rpm. [Paso 1: 500 rpm, 10 s, 100 rpm / s, Paso 2: 2000 rpm, 30 s, 300 rpm / s].
[NOTA: no tienen la oblea con pinzas después de girar SU8] - Soft hornear la oblea a 65 ° C durante 20 min y 95 ° C durante 50 min.
- La oblea se expone a la luz UV a través de una máscara que desee. Dosis de 150 m de altura es de 650 mJ / cm 2.
- Después de la exposición hornear la oblea a 65 ° C durante 1 minuto y 95 ° C durante 12 min.
- Desarrollar la oblea en SU8 desarrollador durante 15 minutos.
Microcanal Maestro Protocolo (500 m de pozos profundos)
- Limpie la oblea con una cuchilla de afeitar, si es necesario. Limpie con acetona, metanol, y el IPA. Realizar el tratamiento de plasma de 50 vatios durante 30 s.
- Giro SU8-2150 @ 1000 rpm. [Paso 1: 500 rpm, 10 s, 100 rpm / s, Paso 2: 1000 rpm, 30 s, 300 rpm / s].
- Soft hornear la oblea a 65 ° C durante 15 min y 95 ° C durante 2 horas y 30 minutos.
- La oblea se expone a la luz UV a través de una máscara que desee. Dosis de exposición para la altura es de 685 micras 650 mJ / cm 2.
- Después de la exposición hornear la oblea a 65 ° C durante 5 minutos ya 95 ° C durante 35 min.
- Desarrollar la oblea en SU8 desarrollador durante 20-30 min.
PDMS preparación de la solución
- Polidimetilsiloxano (PDMS) solución se prepara mediante la mezcla de 10 partes de elastómero de silicona con una parte del agente de curado de un kit estándar Sylgard 184.
- Las burbujas generadas en la solución de PDMS durante el proceso de mezcla se eliminan usando un secador de vacío.
- La burbuja de una solución libre de PDMS es lenta dispensado sobre la SU8 maestros y un vacío placa de Petri para la tercera capa.
- La temperatura de la placa caliente se establece en 75 ° C y el PDMS se cura a esta temperatura durante 2 horas
- Entradas, salidas y los pozos de cambio se troquelan con el golpeador tamaño del orificio adecuado.
- Las capas están unidas entre sí en un portaobjetos de vidrio (tamaño 0,1 mm) utilizando un dispositivo de plasma de mano.
B. Arreglo experimental
- Etanol al 70% el flujo a través del dispositivo de micro-para esterilizar. DI flujo de agua para lavar el etanol. Perfusión de 50 ml de 0,5% de BSA a través del dispositivo para prevenir la no específica de adsorción de la insulina a las paredes de microcanales.
- El gradiente de rampa de la glucosa y otros pendientes relacionadas generados por el software de LabVIEW que se comunica con la jeringa bombas se ponen a prueba para asegurarse de que los gradientes son estables.
- 25-30 islotes ratones fueron incubadas con Fura-2/AM M 5 (un indicador de calcio, sondas moleculares, CA) y 2,5 M rodamina 123 (Rh123, un indicador de potencial mitocondrial, Sigma, MO) durante 30 minutos a 37 ° C en buffer Krebs-Ringer (KRB) que contiene 2 mM de glucosa
- Los islotes de los ratones son cuidadosamente pipeta en el dispositivo de microfluidos perifusion a través del puerto de entrada.
- La red de microfluidos es la configuración de la conexión por la entrada de las bombas de jeringa con tubo Tygon y un conector en la salida al colector de fracciones. El dispositivo se encuentra en una fase de calentamiento (37 ° C) en el microscopio y el tubo de admisión se calienta en un hornillo para mantener la temperatura de la cámara y la solución a 37 ° C.
- Inmediatamente después de la instalación, los islotes de los ratones son perifused con KRB conteniendo 2 mM de glucosa durante 10 minutos y luego una rampa de glucosa (2 mM 25 mM) durante 25 min.
- Lapso de tiempo las imágenes se recogen y analizan cada 15 s por el software SimplePCI. El perifusate también se recoge cada minuto con un colector de fracciones para analizar la secreción de insulina por ELISA kit.
Resultados representante
Islotes de ratón se perifused con un gradiente lineal de 2-25 mM de glucosa. Como se muestra en la Figura 1, la entrada de calcio y la secreción de insulina se activan después de unos 13 minutos de perifusion, lo que corresponde a la glucosa de 6 mm. Cambios en los potenciales mitocondriales son visto antes como era de esperar, a unos 11 minutos. Estos datos demuestran la ventaja de utilizar esta red de microfluidos para caracterizar la fisiología del islote.
Figura 1. Las respuestas fisiológicas a la estimulación de células islote.
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Discussion
Los sistemas tradicionales de perifusion islote (macroescala y microescala) tienen algunas limitaciones, incluyendo complejos de configuración y diseño, altos requerimientos técnicos, y la dificultad para crear prescrito por el usuario gradientes químicos en el sistema. El sistema de microfluidos perifusion descrito aquí supera estas limitaciones con la simple geometría de diseño y fabricación. Más importante aún, este sistema puede ser integrado con el enfoque de imágenes de fluorescencia que proporcionan una herramienta única para estudiar la fisiología del islote. El sistema ha demostrado con una alta relación señal-ruido y espacio-temporal de la resolución de estas señales de fluorescencia. El prototipo actual puede tener múltiples configuraciones perifusion en un chip y ofrecen distintos tipos de microambientes para fines de aplicación generalizada.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por AAUW internacional de becas para Adeola Adewola, NIH / CNRR (U42RR023245) a José Oberholzer, y el Proyecto de Diabetes de Chicago.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60ml Syringes | BD Biosciences | ||
| Fura-2 fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine123 Fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30" Silicone tubings | Cole-Parmer | 1/16 x 1/8in | |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16” & 4mm | |
| Syringe connectors | Cole-Parmer | female luer plug 1/16” | |
| Straight connectors | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Elbow connector | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Havard syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Perifusion device | |||
| Hot plate | PMC | ||
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Fraction collector | Gibson | ||
| Pippettor | Fisher Scientific | ||
| Inverted epiflorescence microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Charge-coupled device | QImaging | Retiga-SRV, Fast 1394 |
References
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
