Summary
Un dispositivo microfluidic perifusion isolotto è stato sviluppato per la valutazione della secrezione insulinica dinamica di isole multiple e simultanee imaging di fluorescenza di afflusso di calcio e mitocondriale potenziali cambiamenti.
Abstract
Un dispositivo microfluidic perifusion isolotto è stato sviluppato per la valutazione della secrezione insulinica dinamica di isole multiple e simultanee imaging di fluorescenza di afflusso di calcio e mitocondriale potenziali cambiamenti. Il dispositivo è costituito da tre strati: primo strato contiene un array di microscala pozzi (500 micron di diametro e 150 micron di profondità) che aiutano a immobilizzare le isolette, mentre esposto al flusso e massimizzare la superficie esposta delle isole, il secondo strato contiene una circolare perifusion camera (3 mm di profondità, 7 mm di diametro) e il terzo strato contiene un ingresso di miscelazione dei canali che i fan prima dell'iniezione nella camera perifusion (2 mm in larghezza, 19 mm di lunghezza e 500 micron di altezza) per l'ottimizzazione l'efficienza di miscelazione prima di entrare nella camera di perifusion. La creazione di gradienti di glucosio diverse tra cui una lineare, forma a campana, e forme squadrate può anche essere creato nella rete perifusion microfluidica ed è dimostrato.
Protocol
Microfabrication A. di 3-strati dispositivo perifusion microfluidica
Bene fondo Maestro protocollo (150 micron pozzi profondi)
- Pulire le fette che utilizzano una lama di rasoio, se necessario. Pulire con acetone, metanolo, e IPA. Eseguire il trattamento al plasma a 50 Watt per 30 secondi
- Spin SU8-100 @ 2000 rpm. [Fase 1: 500 giri, 10 s, 100 giri / s, Fase 2: 2000 rpm, 30 s, 300 giri / s].
[NOTA: non tenere il wafer con una pinzetta dopo filatura SU8] - Morbido cuocere il wafer a 65 ° C per 20 min e 95 ° C per 50 min.
- Il wafer viene esposto alla luce UV attraverso una maschera desiderata. Dose per 150 micron altezza è di 650 mJ / cm 2.
- Post-esposizione cuocere il wafer a 65 ° C per 1 minuto e 95 ° C per 12 min.
- Sviluppare il wafer in SU8 sviluppatore per 15 min.
Microcanali Maestro protocollo (500 micron pozzi di profondità)
- Pulire le fette che utilizzano una lama di rasoio, se necessario. Pulire con acetone, metanolo, e IPA. Eseguire il trattamento al plasma a 50 Watt per 30 secondi
- Spin SU8-2150 @ 1000 rpm. [Fase 1: 500 giri, 10 s, 100 giri / s, Fase 2: 1000 rpm, 30 s, 300 giri / s].
- Morbido cuocere il wafer a 65 ° C per 15 minuti e 95 ° C per 2 ore e 30 min.
- Il wafer viene esposto alla luce UV attraverso una maschera desiderata. Dose di esposizione per 650 micron altezza è 685 mJ / cm 2.
- Post-esposizione cuocere il wafer a 65 ° C per 5 minuti e 95 ° C per 35 min.
- Sviluppare il wafer in SU8 sviluppatore per 20-30 min.
PDMS soluzione di preparazione
- Polidimetilsilossano (PDMS) soluzione viene preparata mescolando accuratamente da 10 parti di elastomeri di silicone con 1 parte di catalizzatore di un kit standard Sylgard 184.
- Le bolle generate nella soluzione PDMS durante il processo di miscelazione vengono rimossi con un essiccatore a vuoto.
- La bolla senza soluzione di PDMS sta lentamente erogato sulla SU8 maestri e un piatto vuoto Petri per il terzo strato.
- La temperatura della piastra è impostato a 75 ° C e il PDMS è curata a questa temperatura per 2 ore
- Insenature, prese e pozzi di cambio sono perforati utilizzando l'apposito perforatrice dimensioni.
- Gli strati sono legati insieme su un vetrino (dimensioni 0,1 mm) utilizzando un dispositivo palmare plasma.
B. Apparato Sperimentale
- Etanolo al 70% del flusso attraverso la micro-dispositivo per la sterilizzazione. DI flusso d'acqua per lavare l'etanolo. Profumato 50 ml di BSA 0,5% attraverso il dispositivo per evitare l'adsorbimento non specifico di insulina alle pareti microcanali.
- La rampa di pendenza di glucosio e di altre pendenze legate generati dal software LabVIEW che comunica con la siringa sono testati pompe per assicurarsi che le pendenze sono stabili.
- 25-30 isolotti topi sono stati incubati con 5 Fura-2/AM mM (un indicatore di calcio, sonde molecolari, CA) e 2,5 mM rodamina 123 (Rh123, un indicatore potenziale mitocondriale, Sigma, MO) per 30 minuti a 37 ° C in Krebs-Ringer buffer (KRB) contenente 2 glucosio mM
- Gli isolotti topi vengono attentamente pipettati nel dispositivo perifusion microfluidi attraverso la porta di entrata.
- La rete è l'installazione della microfluidica collegando l'ingresso alle pompe siringa usando tubi Tygon e di un connettore a Y e la presa di raccoglitore di frazioni. Il dispositivo si siede su una fase di riscaldamento (37 ° C) sul microscopio e il tubo di aspirazione viene riscaldata su una piastra per mantenere la temperatura della camera e la soluzione a 37 ° C.
- Immediatamente dopo l'installazione, gli isolotti topi sono perifused con KRB contenente 2 mM glucosio per 10 minuti e poi una rampa di glucosio (2mm 25mm) per 25 min.
- Time-lapse immagini vengono raccolti e analizzati ogni 15 s da un software SimplePCI. Il perifusate è anche raccolto ogni minuto usando un raccoglitore di frazioni di analizzare alla secrezione insulinica mediante il kit ELISA.
Rappresentante Risultati
Isolotti del mouse sono stati perifused con una sfumatura lineare di 2-25 mM glucosio. Come mostrato nella Figura 1, afflusso di calcio e la secrezione di insulina sono innescate dopo circa 13 minuti di perifusion, corrispondenti a 6 mM glucosio. Cambiamenti nelle potenzialità mitocondriali sono visto in precedenza come previsto, a circa 11 minuti. Questi dati dimostrano il vantaggio di utilizzare questa rete microfluidica per caratterizzare isolotto fisiologia.
Figura 1. Reazioni fisiologiche alla stimolazione delle cellule insulari.
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Discussion
I sistemi tradizionali di perifusion isolotto (macroscala e microscala) hanno alcune limitazioni tra cui complesso di configurazione e design, elevate esigenze tecniche, e la difficoltà di creare utenti prescritto gradienti chimici nel sistema. Il sistema perifusion microfluidica descritto qui di superare queste limitazioni con geometria semplice di progettazione e fabbricazione. Più importante, questo sistema può essere integrato con l'approccio di imaging a fluorescenza che forniscono come uno strumento unico per studiare la fisiologia isolotto. Il sistema ha dimostrato con elevato rapporto segnale-rumore e spazio-temporale risoluzione di questi segnali di fluorescenza. Il dispositivo prototipo attuale anche in grado di contenere perifusion configurazioni multiple in un unico chip e fornire diversi tipi di microambienti per scopi applicazione diffusa.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da AAUW internazionale borsa di studio per Adeola Adewola, NIH / NCRR (U42RR023245) a Jose Oberholzer, e il Progetto Diabete Chicago.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60ml Syringes | BD Biosciences | ||
| Fura-2 fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine123 Fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30" Silicone tubings | Cole-Parmer | 1/16 x 1/8in | |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16” & 4mm | |
| Syringe connectors | Cole-Parmer | female luer plug 1/16” | |
| Straight connectors | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Elbow connector | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Havard syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Perifusion device | |||
| Hot plate | PMC | ||
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Fraction collector | Gibson | ||
| Pippettor | Fisher Scientific | ||
| Inverted epiflorescence microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Charge-coupled device | QImaging | Retiga-SRV, Fast 1394 |
References
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
