デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を用いたマウス大腸炎モデル

Summary

飲料水で投与デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）は、急性大腸炎の確立されたマウス炎症性損傷モデルです。このプロトコルは、DSSの治療や組織の準備のための方法を概説します。

Abstract

- クローン病大腸炎特に潰瘍性大腸炎およびクローン病の大腸亜種、大腸炎は、ウイルスや細菌感染症、虚血性傷害、または自己免疫疾患から発生する可能性があります。急性大腸炎は、腹痛や膨満、吸収不良、下痢、血便、便中の粘液を呈することがある。我々は環境、遺伝学、および大腸の炎症性腸疾患と動物モデルにおける上皮のバリア機能不全この疾患の我々の理解を進める上で不可欠であったとの間の複雑な相互作用を理解し始めている。一つの人気モデルは数日間続く上皮損傷と大腸で堅牢な炎症反応の結果、低分子量デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）でマウスの飲料水を補完する関係

Protocol

パート1：傷害 - 修復大腸炎モデル

1. ベースラインの重量は、DSSの治療を開始する前に、各マウスのために取得する必要があります。
2. 3％（w / v）のデキストラン硫酸ナトリウム塩の水溶液と0.45μmのセルロースアセテートフィルターでフィルターを作成します。
3. 四日間のための3％DSS溶液を用いてマウスのケージに飲料水を交換してください。マウスは、水の他のソース（すなわち、排除のヒントは、自動給水システム上に配置）へのアクセスを持つべきではありません。
4. 4日目に、いくつかの結腸上皮の回復を可能に、さらに3日間、水とDSSソリューションを交換してください。マウスは大腸炎の全身的影響を定量化するために4日目に体重を測定する必要があります。体重減少は深刻な損傷と共通です。
5. 7日目に、マウスの重量を測定し、生け贄に捧げる。マウスは、イソフルラン、または他の制度の吸入過剰投与により安楽死することができる、IACUCは方法を承認した。

パート2：コロンの剖検と収穫

1. 腹部への遮るもののないアクセスを確保するために、マウスで安全な脚の腹側を公開します。 70％エタノールで完全に腹部を濡らす。
2. 組織鉗子による腹部の正中線をつかみ、テン肌をこのように上向きに延長する。腹部の内容を公開するため、腹部を切開するために先の細いはさみを使用してください。正中線でxyphoidプロセスの先端に切開を延長し、二国間沿岸マージンの下面に沿って延びている。
3. 小腸、盲腸、結腸を識別します。周囲の腸間膜からコロンを慎重に解剖/いじめる。遠位結腸と直腸を解放するために骨盤内の深いコロンを横に切断する。近位結腸を解放するcolonocecalマージンでコロンを横に切断する。ケアは、穿孔が発生した場合にコロンが問題となる洗浄としてコロンを傷つけないように、このプロセス中に注意する必要があります。
4. 20G送り針と10mlのシリンジを使用して、挿管と溶出液が糞便の完全に透明になるまで氷冷したPBSでコロンをフラッシュする。
5. 解剖顕微鏡で肉眼的分析が必要な場合は、この時点で、、コロンは"ソーセージ"として固定することができます。もし組織学的分析は、"急性大腸炎の組織学的分析のためにスイスロールを作る"第4部に進むよりも望まれている。

パート3：結腸全体の巨視的分析のための"ソーセージ"として処理

1. コロンの正しい向きを維持することが重要である、従って、オペレータに最も近い大腸の遠位端を保持。非吸収性縫合糸の2つの部分（SP116 1.5メトリック編みシルク）、長さは1約1インチ、他の2インチカット。
2. それでも良好なシール性を維持しながら可能な限り余裕の近くに遠位端をオフに結びつけるため縫合の2インチの部分を使用してください。
3. 10％の5mlを含む20G送り針が大腸の近位端にリン酸ホルマリンをバッファに置きます。疎供給針の球のすぐ近位縫合糸の残りの部分を結ぶ。供給針の電球でしっかりとコロンをつかんで、コロンが展開されるまで、ホルマリン注入する。あなたがこのように、"ソーセージ"として注入された、拡張されたコロンを残して、摂食針を撤回として縫合糸の結び目を締めます。
4. 10％がリン酸ホルマリンをバッファリングし、チューブにコロンを置くと15 mlコニカルチューブを埋める。 24時間を修正しました。
5. ホルマリンを捨て、追加の24時間、70％EtOHで交換してください。 （コロンは、室温で無期限に70％エタノールで保存することができます。）
6. コニカルチューブからコロンを削除し、コロンを傷つけないように注意しながら、メスで両端にある文字列をカット。遠位端は、文字列の最長の部分を持っていることに注意してください。それは長いシートを形成するように遠位から結腸の近位端に縦にカット。この時点で、コロンは、解剖顕微鏡下で見ることができます。

パート4：急性大腸炎の組織学的分析のためのスイスロールの作成

1. コロンの正しい向きを維持することが重要である、従って、オペレータに最も近い大腸の遠位端を保持。
2. 大腸の長さを測定します。このメトリックは、傷害の重症度の別の指標です。大腸炎は、浮腫が増加し、全体的な大腸の長さが短くなります。
3. 先の細いはさみを使用して、遠位から結腸の近位端に縦に切開する。このように平らなシートとしてコロンを表示する、切開のいずれかの端を持ち、遠位 - >近位に、あなたのように働く横方向に開くように微細な先端鉗子を使用してください。
4. コロンローリングピンセットと両手のテクニックが必要です。鉗子と遠位マージンのいずれかの端をつかみます。順次近位縁に進む鉗子を回転させ、解放することによって大腸をロールに進んでください。従って、三次元または"スイスロール"で螺旋を生成する。ロール状を維持するために、鉗子でしっかりとロールを把握し、27G1 / 2針でそれを横に切断する。それが終了するロールを次のように針を曲げて針を固定します。
5. 10％の瓶で適切に標識された組織のカセットと場所でロールを配置するには、組織の固定を確実にするために24時間室温でリン酸ホルマリン緩衝化。
6. ホルマリンを捨て、追加の24時間、70％EtOHで交換してください。 （コロンは、室温で無期限に70％エタノールで保存することができます。）
7. サンプルを修正したら、それはパラフィン包埋、切片と組織学的分析のためのスライド上にマウントすることができます。

パート5：代表的な結果

急性大腸炎のためのDSSモデルは、研究者は、取得する修正、およびそのモデル急性大腸炎大腸を分析することができます。 （図1）適切にロールバックならスイスロールをカットしてマウントされると、それは全体のコロンの代表的なスライスを形成すべきである。マウントされているロールは、遠位（内側）の端から近位（外側）の端（図2）に、コロンに損傷の程度を決定するために、H＆Eで染色することができます。免疫組織化学はまた、炎症性細胞浸潤を同定および定量するためにスイスロールで実行することができます。ソーセージのメソッドが正しく実行されている場合は、固定されたコロンは瞳孔が開いされ、全体の粘膜表面は、容易に改ざんし、解剖顕微鏡（図3）の下に表示することができます。

図1適切に実行される"スイスロール"。 （A）コロンは、近位端に遠位からロール針でtransectedと針の端を折り曲げて固定されています。その後、固定のために組織カセットに配置されます。 （B）H＆Eは、DSS（D =遠位結腸P =近位結腸）で治療したマウスの結腸で作られたスイスロールの5μmのセクションを染色した。

図2：DSS扱わコロンは急性大腸炎の徴候を示す。炎症と陰窩の損傷は、水処理対照と比較してDSS処理コロンで明白である。

図3。"ソーセージ"の例。ソーセージは、ホルマリンを注入し、完全に拡大した。わずかな角度は、コロンの自然な湾曲に存在し、セカンダリになります。開かれたソーセージは、平らになるように置いてください。

Discussion

このプロトコルは、急性損傷、傷害、修復、または慢性の結腸傷害のプロセスをモデル化するように変更することができます。

急性傷害の変更：

即時の犠牲に続いて4-6日のためのDSSの治療のアドリブ

傷害修復の変更：

3-4日と犠牲の回復期間（上記のプロトコルで説明されている）に続いてDSS治療の4-6日で負傷。

慢性大腸炎の変更：

マウスは、各サイクルの間に回復十六日に3％DSSの三五日間のサイクルで配置されます。マウスは、最後の16日間の休止期間後に屠殺されています。

研究者はこのモデルでの注意が必要ないくつかの問題があります。

1. 損傷部位のばらつきは：私たちの手で、我々は、近位結腸と盲腸の相対的な温存で、主に遠位傷害のパターンを参照してください。その他には、傷害のパターンにより近位の優位性を報告している。
2. 環境変動。大きな環境変動があります。これは、部分的に、腸内細菌、食事や他の環境への配慮の違いに起因する可能性があります。
3. 高分子量のDSSが（50万Daをすなわち）に使用されている場合は、このモデルは効果がない。
4. このモデルの⁴かなりのひずみのばらつきがあります。

コロンの生化学的解析は、近位または遠位のマージンからサンプルを取ることによって行うことができます。傷害の重症度にもよりますが、これは組織学的傷害のスコアを生成する能力に影響を与える可能性があります。 in vivoでのBrdUで増殖を測定するためのラベリングは、α- BrdUのIHC処理に続いて犠牲にする前に16.7μg/ kgのBrdUを2時間の腹腔内注射することによって達成することができます。

"ソーセージ"の代わりに、コロンは完全にフラットに固定することができます。ワットマン濾紙とタッパーウェア容器の底部と10％の紙を浸すの行は、リン酸ホルマリン緩衝化。 "：コロンの剖検及び収穫パート2"で説明されているようにコロンを細かく分析。再び、オペレータに最も近い大腸の遠位端を保持。先の細いはさみを使用して、遠位から結腸の近位端に縦に切開する。微細な先端鉗子で平坦なシートのようにコロンを表示し、切開の縁と横方​​向に働くオープンのどちらかを把握する。事前に浸したワットマン濾紙にこのフラットシートを転送します。 10％がリン酸ホルマリンをバッファリングしてワットマンとウェットの別の部分で平らにコロンをカバー。ワットマンは、完全にホルマリンで覆われて、それはコロンをオフに持ち上げることがあまりできないようにする必要があります。タッパーウェアをシールし、24時間修正。タッパーウェアからコロンを削除し、15 mlコニカルチューブに10 mlの70％エタノールに入れてください。 （コロンは、室温で無期限に70％エタノールで保存することができます。）

結腸傷害^5,6,7を定量^するためのいくつかの方法があります。炎症、どの程度の関与、再生、地下損傷、およびパーセントの関与^8：一つの方法は、例えば、を含む、マルチパラメータのスケールを使用しています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran Sulfate Sodium Salt	USB Corp., Affymetrix	9011-18-1	mol wt 40,000-50,000
10% Buffered Formalin Phosphate	Fisher Scientific	SF100-4
Isoflurane, USP	Phoenix Pharmaceuticals, Inc.	NDC 57319-474-06
TISSUE PATH Macrosette Cassettes	Fisher Scientific	15182706
BD 10 ml Syringe	BD Biosciences	309604
Ethyl Alcohol	Pharmco-AAPER	E190	Dilute to 70% with distilled water
20G Straight Feeding Needle	VWR international	20068-612
27G1/2 PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	305109
Dissecting Scissors Sharp/Blunt Tip	VWR international	82027-588
Waugh Forceps	VWR international	82027-428
Non-absorbable Suture	LOOK Surgical	SP116
Whatman Blotting Paper	VWR international	28298-020	Cut as needed
Nalgene Surfactant-Free Cellulose Acetate (SFCA) Filter	Cole-Parmer	EW-06731-2
Carbon fiber composites digital caliper	Fisher Scientific	15-007-958