Summary
Dextransulfat natrium (DSS) administreras i dricksvatten är en etablerad mus-inflammatoriska skador modell av akut kolit. Detta protokoll föreslås en metod för DSS behandling och beredning av vävnader.
Abstract
Kolit kan uppstå från virus eller bakteriella infektioner, ischemisk förolämpning eller autoimmuna sjukdomar, främst ulcerös kolit och kolon variant av Crohns sjukdom - Crohns kolit. Akut kolit kan innebära med buksmärtor och dilatation, malabsorption, diarré, Hematochezia och slem i avföringen. Vi börjar förstå de komplexa sambanden mellan miljö, genetik och epitelceller barriär dysfunktion vid inflammatorisk tarmsjukdom och djurmodeller av kolit har varit väsentliga för att öka kunskaperna om denna sjukdom. En populär modell Komplettera dricksvatten av möss med låg molekylvikt Dextran natriumsulfat (DSS), vilket resulterar i epitelial skador och en robust inflammatorisk reaktion i tjocktarmen varar flera dagar
Protocol
Del 1: Skador-Repair Kolit Modell
- Kroppsvikt bör erhållas för varje mus innan du börjar DSS behandling.
- Gör en 3% (w / v) dextransulfat lösning Natriumsalt i vatten och filtrera med ett 0,45 ìm cellulosaacetat filter.
- Byt ut dricksvatten i mus bur med 3% DSS lösning för fyra dagar. De möss bör inte ha tillgång till någon annan källa med vatten (dvs uteslutning tips placeras på automatiserade bevattningssystem).
- På dag fyra, byt DSS lösning med vatten i ytterligare tre dagar, vilket gör att en del kolon epiteliala återhämtning. Mössen ska vägas på dag fyra i syfte att kvantifiera systemiska konsekvenser av kolit. Viktminskning är vanligt med allvarliga skador.
- Dag 7, väga och offra möss. Möss kan avlivas genom inhalation överdos av isofluran eller andra institutionellt, godkända IACUC metoder.
Del 2: obduktion och skörd av Colon
- Exponera ventrala sidan av musen och säkra ben för att garantera obehindrad tillgång till buken. Blöt buken helt med 70% etanol.
- Ta tag i mittlinjen av buken med vävnad pincett och sträcker sig uppåt därmed camping huden. Använd spetsig sax incisionsfilm buken därmed utsätta buken innehåll. Utöka snittet till toppen av xyphoid processen på mittlinjen och sedan sträcka sig längs de underlägsna aspekten av costal marginalerna bilateralt.
- Identifiera tunntarmen, blindtarmen och tjocktarmen. Försiktigt dissekera / reta tjocktarmen från den omgivande tarmkäx. Transekt tjocktarmen djupt i bäckenet för att frigöra den distala tjocktarmen och ändtarmen. Transekt tjocktarmen vid colonocecal marginalen till fri den proximala kolon. Man måste vara försiktig under denna process inte skada kolon som rengör tjocktarmen blir problematiskt om perforering uppstår.
- Med hjälp av en 20G utfodring nål och 10 ml spruta, intuberas och spola kolon med iskalla PBS tills eluatet är helt fri från avföring.
- Vid denna punkt, om makroskopisk analys med en dissekera mikroskop önskas, kan kolon fastställas som "korvar". Om histologisk analys bara önskas än vidare till del 4 "Göra schweiziska Rolls för den histologiska analysen av akut kolit".
Del 3: Bearbetning som "Korv" för makroskopisk analys av hela tjocktarmen
- Det är viktigt att behålla rätt orientering i tjocktarmen, därför håller den distala änden av tjocktarmen närmast föraren. Klipp två bitar av icke-absorberbara suturer (SP116 1,5 metriska flätat silke), en ca 1 tum i längd, den andra 2 inches.
- Använd 2 tum bit sutur att knyta upp den distala änden så nära marginal som möjligt samtidigt bibehålla en bra tätning.
- Placera en 20G utfodring nål som innehåller 5 ml 10% buffrad formalin fosfat i proximala slutet av tjocktarmen. Löst binda resterande bit sutur omedelbart proximalt om glödlampan för utfodring nålen. Ta tag i tjocktarmen ordentligt på glödlampan för utfodring nål och ingjuta formalin fram till tjocktarmen är expanderat. Dra åt knut på suturen som du återkalla utfodring nålen, vilket lämnar den infunderade expanderade kolon som en "korv".
- Fyll en 15 ml koniska rör med 10% buffrad formalin fosfat och placera kolon i röret. Fix i 24 timmar.
- Häll bort formalin och ersätt med 70% EtOH för ytterligare 24 timmar. (Kolon kan lagras i 70% EtOH obegränsad tid vid rumstemperatur.)
- Ta bort tjocktarmen från det koniska röret och kapa strängarna på varje ände med en skalpell och var försiktig så du inte skadar tjocktarmen. Kom ihåg att den distala änden har längst snöre. Klipp längs från distalt proximala änden av tjocktarmen så att den bildar en lång plåt. Vid denna punkt kan tjocktarmen ses i dissekera mikroskop.
Del 4: Att göra schweiziska Rolls för den histologiska analysen av akut kolit
- Det är viktigt att behålla rätt orientering i tjocktarmen, därför håller den distala änden av tjocktarmen närmast föraren.
- Mät kolon längd. Det här måttet är en annan indikator på svårighetsgraden av skada. Kolit ökar ödem och förkortar den totala kolon längd.
- Använda spetsig sax, incisionsfilm longitudinellt från distalt proximala änden av tjocktarmen. Använd fin tippade pincett för att greppa kanten på snitt och öppna sidled arbeta dig distalt-> proximalt, vilket visar kolon som en platt ark.
- Rullande tjocktarmen kräver en pincett och en två räckte teknik. Ta tag i kanten på distal marginal med pincett. Gå vidare till sekventiellt rulla tjocktarmen genom att rotera och släppa pincett fortsätter till den proximala marginalen. Vilket genererar en spiral med en tredje dimension eller "Rulltårta".För att upprätthålla rullade formen, ta tag i rullen ordentligt med pincett och transekt den med en 27G1 / 2 st. Fäst nålen genom att böja nålen när det lämnar rullen.
- Placera rullen i en korrekt märkta vävnad kassetten och lägg i en burk med 10% buffrad formalin fosfat i rumstemperatur i 24 timmar för att säkerställa vävnad fixering.
- Häll bort formalin och ersätt med 70% EtOH för ytterligare 24 timmar. (Kolon kan lagras i 70% EtOH obegränsad tid vid rumstemperatur.)
- När provet har fastställts, kan det vara paraffininbäddade, sektioneras och monteras på objektglas för histologisk analys.
Del 5: representativa resultat
DSS modell för akut kolit kan forskaren få, korrigera och analysera ett kolon att modeller akut kolit. När Rulltårta kapas och monteras bör den utgöra en representativ bit av hela tjocktarmen om rullade på rätt sätt (Figur 1). Den monterade rullen kan färgas med H & E för att fastställa omfattningen av skador på tjocktarmen, från den distala (inuti) slut på den proximala (utanför) ände (figur 2). Immunohistokemi kan också utföras på Rulltårta att identifiera och kvantifiera inflammatoriska infiltrat. Om korven metoden har utförts korrekt, kommer den fasta tjocktarmen vara dilaterade och hela slemhinneepitel lätt kan manipuleras och visas under dissekera mikroskop (Figur 3).
Figur 1. Korrekt utförda "rulltårta". (A) kolon rullas från distalt proximala änden, transected med en nål och säkras genom att böja i slutet av nålen. Det är sedan placeras i en vävnad kassett för fixering. (B) H & E målat 5 ìm avsnitt av en rulltårta gjord av tjocktarmen som en mus som behandlats med DSS (d = distala kolon p = proximala colon).
Figur 2. DSS behandlas kolon visar tecken på akut kolit. Inflammation och crypt skador är tydligt i DSS-behandlade kolon jämfört med ett vatten som behandlats kontroll.
Figur 3. Ett exempel på en "korv". Korven infunderas med formalin och helt utökas. En liten vinkel kommer att vara närvarande sekundära till den naturliga krökning av tjocktarmen. Den öppnade korven ska ligga plant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll kan modifieras för att modellera akut skada, skada, reparation, eller kronisk kolon processer skada.
Akut skada Ändring:
DSS behandling ad lib i 4-6 dagar följt av omedelbar offer
Skador-Reparation Ändring:
Skada med 4-6 dagars DSS behandling följt av återhämtning under 3-4 dagar och offer (som beskrivs i ovannämnda protokoll).
Kronisk Kolit Ändring:
Möss är placerade på tre fem-dagars cykler med 3% DSS med sexton dagars återhämtning mellan varje cykel. Möss offras efter den sista 16-dagars viloperiod.
Det finns flera frågor som forskare måste vara medvetna om med denna modell:
- Variabilitet i platsen för skadan: i våra händer, ser vi en övervägande distal skada mönster, med relativt sparsamt av den proximala kolon och blindtarmen. Andra har rapporterat mer proximalt dominans till den skada mönstret.
- Miljö-variabilitet. Det finns en betydande miljö-variabilitet. Detta är sannolikt delvis beroende på skillnader i tarmflorans, kost och andra miljöhänsyn.
- Denna modell är ineffektiv om hög molekylvikt DSS används (dvs. 500 tusen Da).
- Det finns stora påfrestningar variabilitet med denna modell 4.
Biokemiska analys av tjocktarmen kan utföras genom att ta prover från den proximala och distala marginaler. Beroende på graden av skada detta kan påverka din förmåga att generera en histologisk skada poäng. In vivo BrdU märkning för att mäta spridning kan uppnås genom intraperitoneal injektion på 16,7 mikrogram / kg BrdU 2 timmar före offra följt av α-BrdU IHC bearbetning.
Som ett alternativ till "korv", kan tjocktarmen fastställas helt platt. Line botten av en Tupperware behållare med Whatman papper och blöta pappret med 10% buffrad formalin fosfat. Dissekera tjocktarmen som beskrivs i "Del 2: obduktion och skörd av Colon". Återigen, håll den distala änden av tjocktarmen närmast föraren. Använda spetsig sax, incisionsfilm longitudinellt från distalt proximala änden av tjocktarmen. Med fin spets pincett grepp antingen kanten av snittet och öppna sidled arbeta, vilket visar kolon som en platt ark. Överför denna platta blad till pre-indränkt Whatman papper. Täck tillplattat kolon med en annan bit av Whatman och blöta med 10% buffrad formalin fosfat. Den Whatman ska vara helt täckt i formalin men inte så mycket att det lyfter tjocktarmen. Täta Tupperware och fastställa till 24 timmar. Ta bort tjocktarmen från Tupperware och placera den i 10 ml 70% etanol i en 15 ml koniska rör. (Kolon kan lagras i 70% EtOH obegränsad tid vid rumstemperatur.)
Det finns flera metoder för att kvantifiera kolon skada 5,6,7. En metod, till exempel, använder en flera parametrar skala med: inflammation, omfattning engagemang, förnyelse, krypta skador och procent inblandning 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som respektive Vanderbilt IACUC.
Acknowledgments
Finansiering från NIH (1 K08 DK080221-01) och Vanderbilt institutionella fonder utveckling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran Sulfate Sodium Salt | USB Corp., Affymetrix | 9011-18-1 | mol wt 40,000-50,000 |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-474-06 | |
| TISSUE PATH Macrosette Cassettes | Fisher Scientific | 15182706 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-AAPER | E190 | Dilute to 70% with distilled water |
| 20G Straight Feeding Needle | VWR international | 20068-612 | |
| 27G1/2 PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 305109 | |
| Dissecting Scissors Sharp/Blunt Tip | VWR international | 82027-588 | |
| Waugh Forceps | VWR international | 82027-428 | |
| Non-absorbable Suture | LOOK Surgical | SP116 | |
| Whatman Blotting Paper | VWR international | 28298-020 | Cut as needed |
| Nalgene Surfactant-Free Cellulose Acetate (SFCA) Filter | Cole-Parmer | EW-06731-2 | |
| Carbon fiber composites digital caliper | Fisher Scientific | 15-007-958 |
References
- Okayasu, I. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Martinez, J. A. Deletion of Mtgr1 sensitizes the colonic epithelium to dextran sodium sulfate-induced colitis. Gastroenterology. 131 (2), 579-588 (2006).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Mahler, M. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, G544-551 (1998).
- Aharoni, R. Immunomodulatory therapeutic effect of glatiramer acetate on several murine models of inflammatory bowel disease. J Pharmacol Exp Ther. 318 (1), 68-78 (2006).
- Hahm, K. B. Loss of transforming growth factor beta signalling in the intestine contributes to tissue injury in inflammatory bowel disease. Gut. 49 (2), 190-198 (2001).
- Green, B. T. Adrenergic modulation of Escherichia coli O157:H7 adherence to the colonic mucosa. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 287 (6), G1238-1246 (2004).
- Dieleman, L. A. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
