Tossina induzione ed estrazione di proteine ​​da Fusarium Spp. Culture per studi di proteomica

Summary

Estrazione di proteine ​​per l'analisi proteomica di specie fungine richiede alti livelli di standardizzazione da realizzare in accordo con le informazioni minime su un esperimento di proteomica (MIAPE) le linee guida. Vi presentiamo un video-protocollo che prevede una procedura di minimizzazione pregiudizi sperimentale durante l'induzione della tossina e l'estrazione di proteine ​​da

Abstract

Fusaria funghi filamentosi sono in grado di produrre tossine diverse. Micotossine del genere Fusarium, quali il deossinivalenolo, nivalenolo, T2, zearelenone, fusaric acido, moniliformina, ecc .. avere effetti nocivi sulla salute umana e animale e alcuni sono considerati come fattori di patogenicità. Studi di proteomica hanno mostrato di essere efficace per decifrare i meccanismi di produzione di tossine (Taylor et al., 2008) così come per identificare i fattori patogeni potenziali (Carta et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. Diventa quindi fondamentale stabilire metodi affidabili per il confronto tra gli studi di proteomica al fine di contare su vere differenze si trovano in espressione proteica tra esperimenti, ceppi e laboratori. La procedura che verrà descritta dovrebbe contribuire ad un aumento del livello di standardizzazione delle procedure di proteomica in due modi. Il protocollo girato è usato per aumentare il livello di dettagli che possono essere descritti con precisione. Inoltre, la disponibilità di procedure standardizzate di processo biologico replica dovrebbe garantire una robustezza maggiore di dati, tenendo conto anche del fattore umano all'interno della riproducibilità tecnica della procedura di estrazione.

Il protocollo descritto richiede 16 giorni per il suo completamento: quattordici giorni per le culture e due giorni per l'estrazione di proteine ​​(figura 1).

In breve, i ceppi di Fusarium sono coltivate su terreni solidi per 4 giorni, sono poi manualmente frammentato e trasferito in un media tossina modificata indurre (Jiao et al, 2008.) Per 10 giorni. Micelio viene raccolto per filtrazione attraverso uno strato Miracloth. Rettifica è eseguita in una camera fredda. Diversi operatori effettuato l'estrazione repliche (n = 3) al fine di tener conto della distorsione dovuta a varianti tecniche (figura 2). L'estrazione è basata su un SDS / DTT tampone, come descritto nella Taylor et al. (2008) con lievi modifiche. Estrazione di proteine ​​totali ha richiesto un processo di precipitazione delle proteine ​​con Aceton / TCA / DTT lavaggio del buffer durante la notte e acetone / DTT (figura 3a, 3b). Proteine ​​sono state finalmente resolubilized nella proteina di etichettatura buffer e quantificati. I risultati dell'estrazione sono stati visualizzati su un gel 1D (Figura 4, SDS-PAGE), prima di procedere alla 2D gel (IEF / SDS-PAGE). La stessa procedura può essere applicata per analisi proteomica su altri substrati di coltivazione e di altri funghi filamentosi (Miles et al., 2007).

Protocol

Il protocollo richiede 16 giorni per il suo completamento. Il calendario dettagliato è in figura 1.

Dettagli per la preparazione del buffer

• Preparazione del tampone di lisi (3 ml per campione).
• Preparazione del tampone di lavaggio (50 mL per campione). Questo buffer deve essere pre-refrigerati e conservati a -20 ° C nel freezer fino a quando ulteriori analisi e tenuta in ghiaccio durante l'intera procedura.
• Preparazione del tampone precipitazioni (20 mL per campione). Questo buffer deve essere pre-refrigerati e conservati a -20 ° C nel freezer fino al momento e tenuta in ghiaccio durante l'intera procedura.
• Il lavoro dovrebbe preferibilmente essere effettuata nella camera fredda a 4 ° C.

Specie fungine

Tre ceppi utilizzati per le analisi proteomiche sono state classificate da Fusarium graminearum sulla base delle loro caratteristiche morfologiche e Traduzione-Allungamento Alfa-1 fattore di analisi (O'Donnell et al., 1998)

Questi ceppi appartenevano alla CRP-Gabriel Lippmann e la raccolta sono stati mantenuti e conservati a - 80 ° C in 15% glicerolo.

Preparazione di miceli

Funghi sono stati coltivati ​​su V8 ​​per 4 giorni a 25 ° C si alternano periodo di chiari e scuri ogni 12 ore. Le culture sono state frammentate con una lama sterile e pezzi di queste culture sono state utilizzate per inoculare beute da 250 ml contenente 100 ml di tossine che inducono i media. Miceli sono state raccolte dopo 10 giorni e sono stati separati dai media filtrando la cultura con un filtro sterile. Miceli sono stati lavati 3 volte con acqua sterile per rimuovere i residui di medie e di altri composti. Abbiamo quindi immediatamente congelato le cellule con l'aggiunta di azoto liquido e conservati i campioni a -80 ° C.

Descrizione generale di estrazione di proteine

Campioni di proteine ​​sono stati estratti con il metodo descritto nella figura 3A e 3B. I campioni sono stati Fusarium terreno in azoto liquido e la polvere sono stati raccolti in 10 ml tubi in Teflon. I campioni sono stati poi incubati 30 minuti con il tampone di lisi, bollita per 10 minuti, 2 volte e centrifugati a temperatura ambiente (12000g per 15 minuti). I surnatanti sono stati raccolti e incubate a -20 ° C con buffer di precipitazioni durante la notte. Dopo centrifugazione a 4 ° C 30000g per 45 minuti, il pellet di proteine ​​precipitate sono state lavate 3 volte con acetone freddo contenente DTT. Infine, i pellet sono stati essiccati e le proteine ​​erano resolubilized nel buffer di etichettatura, la regolazione del pH a 8. Un sub-campione di 30 ml è stato rimosso per la quantificazione delle proteine ​​totali e il surnatante rimanente è stato conservato a -20 ° C fino elettroforesi delle proteine.

Figura 1. Temporale della procedura.

Figura 2. Schema per operatori multipli campione di elaborazione.

Figura 3a.

Figura 3b. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande figura 3a, oppure qui per una versione più grande di figura 3b.

Figure 3a-b diagrammi di flusso per la procedura di estrazione delle proteine ​​(A: primo giorno; B: secondo giorno)..

Figura 4. 1D immagine di estratti proteici. Le proteine ​​sono stati eseguiti fino migrazione completa del blu fino alla fine del gel che era macchiata di viola lava. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 4.

Discussion

Recente interesse per approcci di proteomica all'interno del dominio della biologia fungina ha portato ad un aumento del numero di pubblicazioni utilizzando questa tecnica (come recensione a Kim et al., 2007). Metodi per l'estrazione delle proteine ​​si basano su una combinazione di procedure di estrazione, ma sono spesso scarsamente descritti nelle sezioni metodologiche e richiedono esperienza nel trattare con i metodi di risoluzione dei problemi potenziali.

Come per gli altri "omiche" si avvicina, definizione di standard per l'elaborazione dei campioni e dei dati è essenziale al fine di generare informazioni scientifiche affidabili. Inoltre i campioni e le procedure di manipolazione deve essere adeguatamente descritte in modo da consentire l'interpretazione risultato condiviso tra diversi "omiche" esperimenti. Questo sarebbe essenziale per sfruttare a pieno le potenzialità di cross-data mining nel campo della genomica, proteomica, metabolomica, ... (Morrison et al., 2006). Informazioni minime su un esperimento di proteomica è stato redatto e gruppi di lavoro sono stati creati al fine di affrontare tutti gli aspetti di un esperimento (gel elettroforesi, spettrometria di massa, le interazioni molecolari, modifiche delle proteine, Informatica Proteomica, Sample Processing). Al momento non sono disponibili informazioni definite sulle procedure di trattamento del campione. Data l'importanza delle procedure di estrazione delle proteine ​​nel determinare la qualità finale di studi di proteomica, al fine di attuare procedure che possono aumentare di normalizzazione nel quadro di linee guida MIAPE (Taylor et al., 2007), abbiamo proposto l'uso di un protocollo video detailing sample elaborazione. Descrizione del video di esperimenti possono contribuire ad aumentare considerevolmente il numero di informazioni sul trattamento dei campioni che possono risultare in una migliore riproducibilità dei "omiche" esperimenti (Pasquali, 2007).

Infatti, la riproducibilità attraverso laboratori è un requisito fondamentale per garantire la validità dei risultati proteomica (http://www.fixingproteomics.org). Il cross-laboratorio riproducibilità è influenzata da due fattori: strumentazioni differenti e differenti operatori manipolare campioni.

Nel protocollo descritto, ci proponiamo di svolgere biologici replica che coinvolge più operatori (Figura 2 e video) di aumentare l'affidabilità dei dati (cioè variazione tecnica dei risultati viene preso in considerazione).

La procedura descritta per l'estrazione di proteine ​​si basa sulla scheda di sicurezza e riscaldamento. Ciò è stato già dimostrato di garantire una buona purezza e la quantità di proteine ​​(Ponte 1996). SDS accoppiato con bollente si scioglie pareti delle cellule, delle proteine ​​idrofobiche e previene la formazione di oligomeri che le precipitazioni abortire delle proteine. Ebollizione consente anche l'inattivazione delle proteasi. Lo stesso effetto viene prodotto anche con EDTA, PMSF e completa inibitore della proteasi mini. DTT rimuove ponti disolfuro tra le proteine ​​e facilitare la solubilizzazione delle proteine.

Al fine di rimuovere SDS prima IEF, le proteine ​​vengono precipitate con l'acetone / TCA / DTT. Inoltre, acetone / TCA / DTT precipitazioni permette la rimozione di alcuni contaminanti come i lipidi, acidi nucleici, i sali e / o composti fenolici, quando questi composti sono presenti. Come la SDS, queste molecole prevenire una migrazione bene durante IEF. A seguito di questa precipitazione, è necessario lavare le proteine ​​precipitate con l'acetone / DTT, in modo da eliminare TCA in quanto può interferire con IEF.

Una buona preparazione del campione è la chiave per un buon risultato. Per questo, è anche essenziale per evitare la contaminazione delle proteine ​​dall'ambiente di lavoro con i guanti senza polvere e nel rispetto buone pratiche di laboratorio. Da un punto di vista tecnico, all'interno del protocollo descritto, le fasi più critiche di ottenere quantità sufficienti e la purezza delle proteine ​​sono due fasi. In primo luogo, la fase di macinazione, dove completa distruzione delle cellule è fondamentale per liberare le proteine, e la seconda, la purificazione di proteine ​​totali, una fase che comprende la rimozione della maggior parte dei lipidi, DNA e altri contaminanti che potrebbero interferire con la migrazione delle proteine.

Materials

Media and solutions PDA: 39 g Potato Dextrose Agar (Difco); 1 L distilled water. V8 agar: 200 ml V8 (campbell’s, USA), 2g CaCO3 (Sigma), 16g Agar (DIFCO), 800 ml distilled water Toxin inducing media: 1g K2HPO4, 0.5g KCl, 0.5g MgSO4 7H2O, 10 mg FeEDTA, 2g L glutamic acid, 10g sucrose in 1L of distilled water. Lysis Buffer: 100mL Final concentration Tris-HCL pH8 5mL 50mM 1M SDS 2g or 10mL 2% 20% DTT 500mL 10mM 2M EDTA 20mL 0.1mM 0.5M PMSF 200mL Complete mini protease inhibitor 1 tablet Water Qsp Precipitation Buffer: 100mL Final concentration TCA 20mL 20% DTT 0.1mL 0.1% Aceton Qsp Washing Buffer: 100mL Final concentration DTT 0.1mL 0.1% Aceton 100mL Labelling Buffer (store at -18°C in small aliquots): 1mL Final concentration Urea 140 mg 7M Thiourea 50 mg 2M CHAPS 40 mg 4% Tris 30 μL 30 mM Water 1 mL