Summary
Protein-Extraktion für Proteom-Analysen in Pilzarten erfordert ein hohes Maß an Standardisierung zu erfolgen gemäß den Mindestanforderungen Informationen über ein Proteom-Experiment (MIAPE) Richtlinien. Wir präsentieren ein Video-Protokoll, das ein Verfahren zur Minimierung der experimentellen Bias während Toxin Induktion und Extraktion der Proteine aus schließt
Abstract
Fusarien sind Fadenpilze in der Lage, verschiedene Toxine produzieren. Fusarium Mykotoxinen wie Deoxynivalenol, Nivalenol, T2, zearelenone, fusaric Säure, Moniliformin, etc. .. nachteilige Auswirkungen auf Mensch und Tier Gesundheit und einige werden als Pathogenitätsfaktoren angesehen. Proteomik-Studien erwies sich als wirksam zur Entschlüsselung Toxinproduktion Mechanismen (Taylor et al., 2008) sowie zur Identifizierung potentieller pathogenen Faktoren (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusarien. Es wird daher von grundlegender Bedeutung für zuverlässige Methoden für den Vergleich zwischen Proteom-Studien, um auf wahren Unterschiede in der Proteinexpression zwischen den Experimenten, Zerrungen und Labors gefunden verlassen zu etablieren. Das Verfahren, das beschrieben werden soll, um ein höheres Maß an Standardisierung der Proteom-Verfahren auf zwei Arten beitragen. Die gefilmten Protokoll wird verwendet, um das Niveau der Details, die genau beschrieben werden können, erhöht. Darüber hinaus bildet die Verfügbarkeit von standardisierten Verfahren zur Verarbeitung biologischer sollte eine höhere Robustheit der Daten zu gewährleisten, auch unter Berücksichtigung des menschlichen Faktors im Rahmen der technischen Reproduzierbarkeit der Extraktion.
Das beschriebene Protokoll benötigt 16 Tage für seine Fertigstellung: 14 Tage für Kulturen und zwei Tage für die Protein-Extraktion (Abbildung 1).
Kurz gesagt, Fusarium-Stämmen auf festen Medien für 4 Tage gewachsen, sie sind dann manuell fragmentiert und in eine modifizierte Toxin induziert Medien (Jiao et al, 2008.) Für 10 Tage. Myzel durch Filtration durch ein Miracloth Schicht gesammelt. Schleifen wird in einer Kältekammer durchgeführt. Verschiedene Betreiber durchgeführt Extraktion Wiederholungen (n = 3), um unter Berücksichtigung der Voreingenommenheit aufgrund technischer Veränderungen (Abbildung 2). Die Extraktion wurde auf einem SDS / DTT-Puffer wie in Taylor et al beschrieben ist. (2008) mit leichten Modifikationen. Insgesamt Proteinextraktion erforderte eine Fällung der Proteine mit Aceton / TCA / DTT-Puffer über Nacht und Aceton / DTT Waschen (Abbildung 3a, 3b). Die Proteine wurden schließlich in der Protein-Kennzeichnung Puffer resolubilisiert und quantifiziert. Die Ergebnisse der Extraktion wurden visualisiert auf einem 1D-Gel (Abbildung 4, SDS-PAGE), bevor Sie mit 2D-Gelen (IEF / SDS-PAGE). Das gleiche Verfahren kann für Proteom-Analysen auf anderen Kultursubstrate und andere Fadenpilze (Miles et al., 2007) angewendet werden.
Protocol
Das Protokoll benötigt 16 Tage für seine Vollendung. Der Zeitrahmen ist in Abbildung 1 dargestellt sind.
Details zum Puffer Vorbereitung
- Vorbereitung der Lyse-Puffer (3 ml pro Probe).
- Vorbereitung der Waschpuffer (50 mL pro Probe). Dieser Puffer sollte vorgekühlt werden und bei -20 ° C gelagert in der Tiefkühltruhe bis zur weiteren Analyse und auf Eis gehalten während des gesamten Verfahrens.
- Vorbereitung des Niederschlags-Puffer (20 ml pro Probe). Dieser Puffer sollte vorgekühlt werden und bei -20 ° C gelagert in der Tiefkühltruhe, bis es gebraucht und auf Eis gehalten während des gesamten Verfahrens.
- Die Arbeiten sollten vorzugsweise in die kalte Kammer durchgeführt werden bei 4 ° C.
Pilzarten
Drei Stämme für Proteom-Analysen verwendet wurden klassifiziert, um Fusarium graminearum auf der Grundlage ihrer morphologischen Merkmale und Translation-Elongationsfaktor Alpha-1-Analyse (O'Donnell et al., 1998)
Diese Stämme gehörten zu den CRP-Gabriel Lippmann Sammlung und wurden gepflegt und gelagert bei - 80 ° C in 15% Glycerin.
Vorbereitung der Myzelien
Pilze wurden auf V8 für 4 Tage bei 25 ° C abwechselnd helle und dunkle Periode jeweils 12 Stunden kultiviert. Die Kulturen wurden fragmentiert mit einem sterilen Messer und Stücke von diesen Kulturen wurden verwendet, um 250 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml Toxin-induzierenden Medien zu impfen. Myzelien wurden nach 10 Tagen geerntet und von Medium durch Filtrieren der Kultur mit einer sterilen Filter abgeschieden. Myzelien wurden 3 mal mit sterilem Wasser gewaschen, um mittel-Rückständen und anderen Verbindungen zu entfernen. Wir haben dann sofort die Zellen durch Zugabe von flüssigem Stickstoff eingefroren und hielt die Proben bei -80 ° C.
Allgemeine Beschreibung der Protein-Extraktions-
Protein-Proben wurden extrahiert nach der Methode in der Figur 3A und 3B beschrieben. Der Fusarium-Proben wurden in flüssigem Stickstoff gemahlen und das Pulver wurde in 10 ml Teflon-Röhrchen gesammelt. Die Proben wurden dann 30 Minuten mit dem Lysepuffer inkubiert, 10 Minuten gekocht und zentrifugiert, 2 mal bei Raumtemperatur (12000g für 15 Minuten). Die Überstände wurden gesammelt und bei -20 ° C inkubiert mit Niederschlag Puffer über Nacht. Nach Zentrifugation bei 4 ° C 30000g für 45 Minuten, die Pellets der gefällten Proteine wurden 3 mal mit kaltem Aceton enthält DTT gewaschen. Schließlich wurden die Pellets an der Luft getrocknet und die Proteine wurden bei der Kennzeichnung Puffer resolubilisiert, Einstellung des pH auf 8. Eine Teilprobe von 30 ml wurde für Gesamt-Protein Quantifizierung entfernt und der verbleibende Überstand wurde bei -20 ° C bis Protein-Elektrophorese gespeichert.
Abbildung 1. Timeline des Verfahrens.
Abbildung 2. Scheme für mehrere Betreiber Probe-Verarbeitung.
Abbildung 3a. 
Abbildung 3b. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Figur 3a, oder sehen Sie hier für eine größere Version Bild 3b.
Abb. 3a-b Flussdiagramme für die Protein-Extraktions-Verfahren (A: am ersten Tag; B: zweiter Tag)..
Abbildung 4. 1D Bild von Protein-Extrakten. Die Proteine wurden bis zur vollständigen Migration von blau bis zum Ende des Gels, die mit Lava Lila gefärbten ausgeführt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 4 zu sehen.
Discussion
Das gegenwärtige Interesse an Proteomik Ansätze innerhalb der Pilz-Biologie-Domain zu einer erhöhten Zahl von Veröffentlichungen mit dieser Technik (wie in Kim et al., 2007 reviewed) geführt. Verfahren zur Extraktion der Proteine setzen auf eine Kombination von Extraktionsverfahren, sie sind oft kaum in der methodischen Abschnitten beschrieben und erfordern Fachkenntnisse im Umgang mit den potentiellen Methoden zur Fehlerbehebung.
Wie bei anderen "omics" Ansätze, Standards für die Probe und Datenverarbeitung ist, um verlässliche wissenschaftliche Daten zu generieren unerlässlich. Außerdem Proben und Verfahren der Manipulation soll adäquat beschrieben werden, um gemeinsame Interpretation der Ergebnisse zwischen den verschiedenen "omics" Experimente erlauben. Dies wäre wichtig für eine optimale Nutzung Potentialität der Cross-Data-Mining in der Genomik, Proteomik, Metabolomik, ... (Morrison et al., 2006). Minimum Informationen über ein Proteom-Experiment wurde ausgearbeitet und Arbeitsgruppen wurden eingerichtet, um alle Aspekte eines Experiments (Gel-Elektrophorese, Massenspektrometrie, Molekulare Wechselwirkungen, Protein Modifikationen, Proteomics Informatik, Sample Processing) zu bewältigen. Zur Zeit sind keine definierten Informationen finden Sie auf Probe Verarbeitungsverfahren. Angesichts der Bedeutung der Protein-Extraktions-Verfahren bei der Bestimmung der endgültigen Qualität der Proteom-Studien, um die Verfahren, dass die Standardisierung im Rahmen der MIAPE Richtlinien zu erhöhen (Taylor et al., 2007) implementieren können, haben wir vorgeschlagen, die Verwendung eines Video-Protokoll detailliert Probe Verarbeitung. Video Beschreibung von Experimenten kann wesentlich dazu beitragen, die Zahl der Informationen über die Probenaufbereitung, die in einer besseren Reproduzierbarkeit der "omics" Experimente (Pasquali, 2007) Ergebnis erhöhen können.
In der Tat ist die Reproduzierbarkeit in Labors eine Grundvoraussetzung, um die Gültigkeit Ergebnisse aus der Proteomik (http://www.fixingproteomics.org) zu gewährleisten. Verschiedenen Besetzungen und verschiedenen Betreibern Manipulation Proben: Das Kreuz-Labor-Reproduzierbarkeit wird durch zwei Faktoren beeinflusst.
In dem beschriebenen Protokoll, schlagen wir vor, führen biologische Replikate mit mehreren Betreibern (Abbildung 2 und Video), um die Zuverlässigkeit der Daten (dh technische Variation der Ergebnisse ist zu berücksichtigen) zu erhöhen.
Das Verfahren zur Extraktion der Proteine beschrieben wird, auf SDS und Heizung auf. Dies war bisher gezeigt, dass eine gute Reinheit und Menge der Proteine (Bridge 1996) zu gewährleisten. SDS mit kochendem gekoppelt löst die Zellwände, hydrophobe Proteine und verhindert die Bildung von Oligomeren, die abort Fällung von Proteinen. Boiling ermöglicht auch die Inaktivierung von Proteasen. Der gleiche Effekt wird auch durch EDTA, PMSF und komplette Mini-Protease-Inhibitor produziert. DTT entfernt Disulfidbrücken in und zwischen Proteinen erleichtern Protein Solubilisierung.
Um SDS vor IEF zu entfernen, sind Proteine, die durch Aceton / TCA / DTT gefällt. Darüber hinaus ermöglicht Aceton / TCA / DTT Niederschlag Entfernen einiger Schadstoffe wie Lipide, Nukleinsäuren, Salze und / oder Phenol-Verbindungen, wenn diese Verbindungen vorhanden sind. Wie SDS, verhindern, dass diese Moleküle eine gute Migration während IEF. Nach diesem Niederschlag, ist es notwendig, die ausgefallenen Proteine durch Aceton / DTT, zu waschen, um TCA zu entfernen, da es mit IEF stören können.
Eine gute Vorbereitung der Proben ist der Schlüssel zu guten Ergebnissen. Dafür ist es auch wichtig, um eine Verunreinigung von Proteinen aus dem Umfeld der Arbeit mit puderfrei Handschuhe und Respekt für eine gute Laborpraxis zu vermeiden. Aus technischer Sicht innerhalb der beschriebenen Protokoll werden die wichtigsten Schritte für den Erhalt ausreichender Menge und Reinheit von Proteinen in zwei Phasen. Erstens, die Schleif-Phase, in der völligen Zerstörung der Zelle ist von grundlegender Bedeutung, um Proteine Release, und zweitens, die Reinigung des gesamten Proteine, eine Phase umfasst die Entfernung von der Mehrheit der Lipide, DNA und andere Verunreinigungen, die mit der Migration der Proteine stören können.
Acknowledgments
Wir danken Servane Contal und Boris Untereiner für ihre technischen Beitrag leisten. Wir erkennen die Unterstützung der FNR "FUTOX"-Projekt.
Materials
Media and solutions PDA: 39 g Potato Dextrose Agar (Difco); 1 L distilled water. Toxin inducing media: 1g K2HPO4, 0.5g KCl, 0.5g MgSO4 7H2O, 10 mg FeEDTA, 2g L glutamic acid, 10g sucrose in 1L of distilled water. Lysis Buffer:
Precipitation Buffer:
Washing Buffer:
Labelling Buffer (store at -18°C in small aliquots):
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References
- Bridge, P. Protein Extraction from Fungi. Protein Purification Protocols. , 39-48 (1996).
- Jiao, F. Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture. FEMS Microbiol Lett. 285, 212-219 (2008).
- Kim, Y. Proteomics of filamentous fungi. Trends in Biotechnology. 25, 395-400 (2007).
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- O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. PNAS. 95, 2044-2049 (1998).
- Paper, J. M. Comparative proteomics of extracellular proteins in vitro and in planta from the pathogenic fungus Fusarium graminearum. Proteomics. 7, 3171-3183 (2007).
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- Taylor, C. F. The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE). Nat Biotechnol. 25, 887-893 (2007).
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