Toxinvapen Induktion och Protein Extraction från Fusarium SPP. Kulturer för proteomik studier

Summary

Protein extraktion för proteomik analyser i svamparter kräver höga nivåer av standardisering som skall utföras i enlighet med den minsta information om ett proteomik experiment (MIAPE) riktlinjer. Vi presenterar en video-protokoll som innehåller ett förfarande för att minimera experimentella partiskhet under toxin induktion och protein utvinnas ur

Abstract

Fusaria är fintrådiga svampar kan producera olika toxiner. Fusarium mykotoxiner såsom deoxinivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric syra, moniliformin, etc. .. ha negativa effekter på både människors och djurs hälsa och en del anses vara sjukdomsframkallande faktorer. Proteomik studier visade sig vara effektivt för att dechiffrera mekanismer toxinproduktion (Taylor et al., 2008) samt för att identifiera potentiella patogena faktorer (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) i Fusaria. Det blir därför grundläggande för att upprätta tillförlitliga metoder för att jämföra mellan proteomik studier för att förlita sig på verkliga skillnader i proteinuttryck mellan experiment, stammar och laboratorier. Det förfarande som kommer att beskrivas bör bidra till en ökad grad av standardisering av proteomik förfaranden genom två sätt. Den filmade protokollet används för att öka graden av detaljer som kan beskrivas exakt. Dessutom replikerar tillgång till standardiserade förfaranden för att behandla biologisk bör garantera en högre robusthet av data, även ta hänsyn till den mänskliga faktorn inom den tekniska reproducerbarheten för extraktionsförfarande.

Protokollet beskrivs kräver 16 dagar för slutförande: fjorton dagar för kulturer och två dagar för protein utvinning (figur 1).

Kortfattat är Fusarium stammar odlas på fasta medier i 4 dagar, de är sedan manuellt fragmenteras och överförs till en modifierad media toxin framkalla (Jiao et al, 2008.) Under 10 dagar. Mycel samlas in genom filtrering genom ett Miracloth lager. Slipning utförs i ett kylrum. Olika operatörer som utförs utvinning replikat (n = 3) för att ta hänsyn till bias på grund av tekniska variationer (figur 2). Extraktion byggde på en SDS / DTT buffert enligt Taylor et al. (2008) med smärre ändringar. Totalt protein extraktion krävs en utfällningsprocess av proteinerna med hjälp av Aceton / TCA / DTT buffert natten och aceton / DTT tvätt (figur 3a, 3b). Proteiner slutligen resolubilized i protein-märkning buffert och kvantifieras. Resultat av utvinningen var visualiseras på en 1D gel (Figur 4, SDS-PAGE), innan du fortsätter med 2D-geler (IEF / SDS-PAGE). Samma förfarande kan tillämpas för proteomik analyser på andra växande media och andra fintrådiga svampar (Miles et al., 2007).

Protocol

Protokollet kräver 16 dagar för att fullfölja. Tidsramen är detaljerad i figur 1.

Detaljer för buffert beredning

• Beredning av lyseringsbuffert (3 ml per prov).
• Beredning av tvätt buffert (50mL per prov). Denna buffert bör vara pre-kylda och förvaras vid -20 ° C i frysen tills vidare analys och förvaras på is under hela förfarandet.
• Beredning av nederbörd buffert (20ml per prov). Denna buffert bör vara pre-kylda och förvaras vid -20 ° C i frysen tills det behövs och förvaras på is under hela förfarandet.
• Arbetet bör helst ske i kylrum vid 4 ° C.

Svamparter

Tre stammar som används för proteomik analyser klassades som Fusarium graminearum på grundval av deras morfologiska egenskaper och Översättning-brottöjning Alfa-1 analys (O'Donnell et al., 1998)

Dessa stammar tillhörde den CRP-Gabriel Lippmann insamling och bibehölls och lagras vid - 80 ° C i 15% glycerol.

Beredning av mycel

Svampar odlades på V8 i 4 dagar vid 25 ° C omväxlande ljusa och mörka period varje 12 timmar. Kulturer var fragmenterad med en steril blad och bitar av dessa kulturer användes för att inokulera 250 ml E-kolvar innehållande 100 ml av toxin-inducerande media. Mycel skördades efter 10 dagar och skildes från mediet genom att filtrera kultur med ett sterilt filter. Mycel spolades 3 gånger med sterilt vatten för att avlägsna medelstora rester och andra föreningar. Vi sedan omedelbart frös cellerna genom att tillsätta flytande kväve och förvaras proverna vid -80 ° C.

Allmän beskrivning av proteinet utvinning

Protein prover utvanns med den metod som beskrivs i figuren 3A och 3B. Den Fusarium prover maldes i flytande kväve och pulvret har samlats i 10 ml teflon rör. Proven inkuberas därefter 30 minuter med lyseringsbuffert, kokas i 10 minuter, och centrifugeras 2 gånger i rumstemperatur (12000g i 15 minuter). Den supernatanterna samlades och inkuberas vid -20 ° C med nederbörd buffert över natten. Efter centrifugering vid 4 ° C 30000g i 45 minuter, var pelletar av utfällda proteiner tvättas tre gånger med kallt aceton innehåller DTT. Slutligen var de pellets lufttorkade och de proteiner som var resolubilized i märkning buffert, justera pH till 8. Ett delurval av 30 ml togs bort för total protein kvantifiering och den återstående supernatanten har förvarats vid -20 ° C fram till protein elektrofores.

Figur 1. Tidslinje av förfarandet.

Figur 2. System för flera operatörer prov-bearbetning.

Figur 3a.

Figur 3b. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 3a, eller här för en större version av figur 3b.

Figurer 3a-b Flödesscheman för proteinet extraktionsförfarande (A: första dagen, B: andra dagen)..

Figur 4. 1D bild av protein extrakt. Proteiner drevs tills fullständig migrering av blått till slutet av gelen som var färgade med lava Purple. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 4.

Discussion

Ökande intresse för proteomik strategier inom svampens biologi domänen lett till ett ökat antal publikationer med hjälp av denna teknik (som granskas i Kim et al., 2007). Metoder för protein utvinning förlita sig på en kombination av extraktion förfaranden, de är ofta knappt beskrivs i metodologiska avsnitten och kräver expertis att hantera de potentiella felsökning metoder.

Liksom för andra "omik" metoder, standarder för provtagning och databehandling är mycket viktig för att generera tillförlitlig vetenskaplig information. Dessutom prover och förfaranden manipulation bör vara utförligt beskrivna i syfte att möjliggöra gemensamma resultatet tolkning mellan olika "omik" experiment. Detta skulle vara viktigt för att fullt ut utnyttja potentialen till över data mining inom genomik, proteomik, metabolomik, ... (Morrison et al., 2006). Minsta information om en proteomik experiment har utarbetats och arbetsgrupper har bildats för att ta itu med alla aspekter av ett experiment (gel elektrofores, masspektrometri, Molekylär växelverkan, ändringar Protein, Proteomics informatik, Sample Processing). För tillfället inga definierade information finns på förfaranden prov bearbetning. Med tanke på betydelsen av förfaranden protein utvinning vid fastställandet av den slutliga kvalitet proteomik studier, i syfte att genomföra förfaranden som kan öka standardiseringen inom ramen för MIAPE riktlinjer (Taylor et al., 2007), föreslog vi att använda en video protokoll detaljer prov bearbetning. Video beskrivning av experiment kan bidra väsentligt till att öka antalet uppgifter om prov behandling som kan leda till bättre reproducerbarhet för "omik" experiment (Pasquali, 2007).

Det är reproducerbarhet över laboratorier ett grundläggande krav för att garantera giltigheten av proteomik resultat (http://www.fixingproteomics.org). The cross-lab reproducerbarhet påverkas av två faktorer: olika besättningar och olika operatörer manipulera prover.

I den beskrivna protokollet, föreslår vi att utföra biologiska replikerar med flera olika operatörer (figur 2 och video) för att öka tillförlitligheten i uppgifterna (dvs. tekniska variationen av resultaten beaktas).

Det förfarande som beskrivs för protein utvinning är baserad på SDS och värme. Detta har tidigare visat att garantera en bra renhet och mängd av proteiner (Bridge 1996). SDS tillsammans med kokande löser cellväggar, hydrofoba proteiner och förhindrar bildandet av oligomerer att avbryta utfällning av proteiner. Kokning ger också inaktivering av proteaser. Samma effekt produceras också av EDTA, PMSF och komplett mini-proteashämmare. DTT bort disulfidbryggor inom och mellan proteiner underlätta protein lösningsgörande.

För att ta bort SDS innan IEF, är proteiner fälls ut med aceton / TCA / DTT. Dessutom tillåter aceton / TCA / DTT nederbörd bort vissa föroreningar som lipider, nukleinsyror, salter eller / och fenolföreningar när dessa föreningar är närvarande. Liksom SDS, dessa molekyler förhindrar en bra migration under IEF. Efter detta nederbörd, är det nödvändigt att tvätta utfällda proteiner med aceton / DTT, i syfte att undanröja TCA eftersom det kan störa IEF.

En bra provberedning är nyckeln till goda resultat. För detta är det också viktigt att undvika kontaminering av proteiner från miljö att arbeta med puderfria handskar och respekt för god laboratoriesed. Ur teknisk synpunkt inom det beskrivna protokollet, de mest kritiska stegen för att erhålla tillräcklig mängd och renhet av proteiner är två faser. För det första slipning fas där fullständig destruktion av cellen är grundläggande att de frisätter proteiner och för det andra, rening av totala proteiner, en fas som omfattar avlägsnandet av majoriteten av lipider, DNA och andra föroreningar som kan störa migration av proteiner.

Materials

Media and solutions PDA: 39 g Potato Dextrose Agar (Difco); 1 L distilled water. V8 agar: 200 ml V8 (campbell’s, USA), 2g CaCO3 (Sigma), 16g Agar (DIFCO), 800 ml distilled water Toxin inducing media: 1g K2HPO4, 0.5g KCl, 0.5g MgSO4 7H2O, 10 mg FeEDTA, 2g L glutamic acid, 10g sucrose in 1L of distilled water. Lysis Buffer: 100mL Final concentration Tris-HCL pH8 5mL 50mM 1M SDS 2g or 10mL 2% 20% DTT 500mL 10mM 2M EDTA 20mL 0.1mM 0.5M PMSF 200mL Complete mini protease inhibitor 1 tablet Water Qsp Precipitation Buffer: 100mL Final concentration TCA 20mL 20% DTT 0.1mL 0.1% Aceton Qsp Washing Buffer: 100mL Final concentration DTT 0.1mL 0.1% Aceton 100mL Labelling Buffer (store at -18°C in small aliquots): 1mL Final concentration Urea 140 mg 7M Thiourea 50 mg 2M CHAPS 40 mg 4% Tris 30 μL 30 mM Water 1 mL