脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

Summary

ここで脂質中間相で手動での膜タンパク質の結晶化の試験を設定するにはカフリーの膜構造機能生物学研究グループに実装されたプロシージャが記述されています。

Abstract

脂質中間相を使用して膜タンパク質を結晶化するための詳細なプロトコルが記述されています。このメソッドは、様々に脂質キュービック相としてまたはメソの方法で呼ばれています。メソッドは、X線原核生物と真核生物のタンパク質の結晶構造、単量体であるタンパク質、ホモとヘテロ多量体、発色団含有し、発色団を含まない、とアルファを解決するために使用されているという点で非常に汎用性であることが示されている-ヘリカルとβ-バレルタンパク質。 メソ結晶化に使用しての最近の成功は、人間工学的β2-アドレナリン作動性およびアデノシンA2a Gタンパク質共役受容体である。プロトコルは、モノオレインベースの中間相に膜タンパク質を再構成するため、および手動モードでの結晶化を設定するために表示されている。このような結晶の収穫など、全体的なプロセスの追加の手順は、将来のビデオの記事で対処すべきです。タンパク負荷の中間相を準備するために、手動で結晶化プレートを設定するために必要な時間は約1時間です。

Protocol

構造と機能生物学の分野における重要な焦点は、生物膜（図1）です。現在のセルとサブ細胞小器官を囲む膜は、単に2つの脂質分子を介して分子的に薄い構造であり、タンパク質が点在する。などの脂質とタンパク質の両方に適用される構造や機能が注目されている。しかし、この記事の焦点は、膜タンパク質に限定されています。

膜タンパク質は、分子レベルでどのように機能するかのより良い理解は、次の2つの理由のため求められている。まず、その仕組みを知ることに知的な満足感があります。第二に、タンパク質がどのように機能するかを知ることで、それをすべき修正することができるという見通しに誤動作または特定のアプリケーションのためにそれを変更しても改善するかのが常にあります。薬物設計は、この種の作業の明らかな結果である。膜タンパク質は、分子レベルでどのように動作するかを把握するためのひとつのアプローチは、その構造を決定することです。これは、タンパク質を構成するすべての原子の3次元空間における位置、または少なくともすべての非水素原子を、確立します。我々はこの目的のために使う方法は、高分子X線結晶構造（MX）です。図2は、構造MXを使用して決定された膜タンパク質の例を示しています。蛋白質の回折品質結晶がMXを実行する必要があります。

明らかに、高分子結晶学を用いて構造決定に関わる多くのステップがあります。これを図3に示されています。通常、これらは膜タンパク質のターゲットを識別し、生産、精製して結晶化が含まれます。回折の測定は、家庭やシンクロトロンX線源を用いて結晶上で実行されます。回折データは、分子モデルを搭載している電子密度マップをもたらして処理されます。洗練されたモデルは、、蛋白質の作用のメカニズムを探求し、構造ベースの薬剤設計のために使用することができます。

この記事の焦点は、 メソメソッドで 、いわゆるによって、我々は脂質中間相を用いた膜タンパク質の回折品質の結晶を作る方法を示すことです。最近の方法の見直しとその範囲はリファレンス1（カフリー、2009）で利用可能です。我々はここに続くステップバイステップのプロトコールは、リファレンス2（カフリーとCherezov、2009）に記載されています。

メソの膜タンパク質の結晶化実験での設定に必要な、時間に関連する手順をまとめたフローチャートを図4に示されています。この記事では、赤い破線の線で囲まれたこれらのステップをカバーしています。

第1部：結晶化プレートの準備

1. 作業台上にシラン化顕微鏡のスライドを置きます。
2. 穿孔ダブルスティックスペーサテープのストリップの一方の表面から保護紙のカバーを取り外します（市販の、以下の具体的な試薬および器具の表を参照）。
3. スライドの表面に接触し、テープ、粘着面を下に置きます。
4. brayerやローラーを使用してスライドするためにテープを圧力シール。アルミ箔は、テープと井戸の底を保護するためにローラーの間に配置することができます。
5. その上側の粘着面を露出させるテープから第二紙のカバーを取り外します。
6. ローディングが完了するとすぐに井戸の迅速かつ効率的なシーリングのためのプレートに近接して個々のシラン化カバースリップを配置。

第2部：準備脂質シリンジ

1. 45温度制御されたブロック内の脂質（多くの場合、モノオレインを）置き℃で3分間は、溶融レンダリングする。
2. 脂質は、脂質、タンパク質の混合工程で使用するために2つの100μLガスタイトハミルトンシリンジを準備溶けている間。タンパク質溶液を含むシリンジからテフロンフェラルを取り外します。 （代わりにそのフェルールを残して）その横に脂質を保持する注射器を置きます。
3. 脂質の注射器に（具体的な試薬および器具以下と参考文献3（Cheng ら 、1998）の表を参照）カプラーを接続します。注射器にカプラーを指で締めますが締めすぎないでください。脂質のシリンジのバレルからプランジャーを外します。
4. 脂質は、先に進む前に溶融する必要があることに注意してください。 30μLにピペットを設定し、徐々に溶融脂質の約30μLを取る。ゆっくりすることができますようにエアギャップを導入しないように注意しながら注射器の開放端に溶融脂質をできるだけ多く提供する。
5. 溶融脂質と接触してバレルにプランジャーを置き、ゆっくりとシリンジビデオで示すように垂直に保持してバレルアッププランジャーを進めます。誤ってトラップされる気泡は、プロセスに上昇する必要がありますし、リリースされる。
6. 慎重にシリンジバレルのマーキングを読み取ることでシリンジ内の脂質の量を決定する。
7. FERRをスライドさせカプラから伸びる針上にULE。バレルの上、ゆっくりと優しくカプラーの中核にある針に溶融脂質を強制的にプランジャーを使用してください。

パート3：タンパク質のシリンジを準備

1. タンパク質溶液は4℃、5〜10分間、14,000 gで回転させてください° Cは、結晶化の試験を設定する前に、大きな凝集体を除去する。氷からのタンパク質溶液を除去し、室温で平衡化することができます。
2. でキュービック相を形成したり、完全に水和して閉じるには、使用するタンパク質溶液の体積を計算します。モノオレインのために20℃、水で完全に水和が相図^5（図5）のように約40％の水（質量）で行われます。
3. 25または50μLハミルトンシリンジでタンパク質溶液の必要量を取る。気泡をしないように注意しながらタンパク質の注射器のバレルのプランジャーのテフロンチップ上に溶液を移す。
4. 慎重に針を撤回し、シリンジ内のタンパク質溶液の体積を測定する。それは前のステップで提供されている値と一致する必要があります。
5. 徐々にその開放端と同じ高さを終わらせるバレルまでのタンパク質溶液をインチ。
6. 脂質のシリンジに接続されているカプラーの開放端にタンパク質の注射器をねじ込みます。それは、デバイスが過度に締め付けることではないことが重要です。以上の締めはこの段階で組み立てられた混合装置は、フェルールを損傷し、漏れが発生します。下の締めは、また漏れにつながる。

パート4：ミキシングタンパク質溶液と脂質：メソフェーズを作る

1. 混合効果に、カプラを介して脂質の注射器に、タンパク質の注射器のタンパク質溶液を駆逐親指または人差し指で、その限界に組み立てられた混合ユニットの蛋白質側のプランジャーを進めます。
2. 脂質側のプランジャーは今カプラを介してタンパク質の注射器に戻って脂質の注射器の中身を駆動するために使用されます。
3. プロセスは何度も繰り返され、時折、百通路以上の均一な中間相を生成するために必要とされています。ミキシングの開始時に、カプラを介して前後に材料の動きは常に、余分な力が混合効果に必要とされる、不均一であるとすることができます。最初の混合は通常、サンプルの不均一な曇りの発展を伴っている。均質化が進むにつれ、新興キュービック液晶相の視覚的な外観が行うように、テクスチャは、より均一と粘性立方相の特徴となります。
4. 条件が適切であり、立方晶の形態である場合、分散は、シリンジバレルの光学的に透明に表示されます。従って、シリンジバレルのマーキングがバレルの中間相を介して明らかに読みやすいはずです。
5. 氷の上に短い時間のために注射器のミキサーを配置することにより、混合時のサンプルの非常にわずかな冷却は、均質化と透明性の達成を加速することができます。しかし、それはサンプルを過冷しないことが重要です。
6. 注意これはサンプルの温度は摩擦発熱は^3〜のため上昇する原因となりますので、ミキシング非常に活発なを避けるために注意すべきである。

パート5：ディスペンサーのロード

1. 10μLハミルトンシリンジから針とプランジャーを外します。場所にテフロンフェラルを残す。
2. 小さなコインの助けを借りて、ディスペンサーから固定ナットを取り外します。
3. ラチェットアームが完全に撤退して、注射器を挿入する - そのプランジャーと針なし - ディスペンサーの保持リングを介して。
4. シリンジが直面している固定ナット、ガスケットの側を交換し、シリンジの開放端にしっかりとそれをねじ込む。
   ケアは、シリンジが正しく保持リングの中心にされており、バレルがラチェットアームに平行に整列されていることを確認することも必要となります。両方とも、目で判断することができる。これらの2つの要件は、漏れを避けるために重要です。
5. グリッパーのナットが数回転緩めるとグリップリングを介してプランジャを通過し、注射器の開放端にプランジャーをご案内。完全にラチェットアームを押し下げる。バレルにプランジャーを移動し、それがバレル内で自由と真の移動することを確認してください。それは自由に移動するプランジャーを容易にするために、ガイドバーのネジを緩めるのに役立つことがあります。それがないことを確認してください。そのテフロンチップがバレルのゼロμL目盛り線と揃うまで、プランジャーを押し下げ。ガイドバーのネジが緩んでいた場合、それを締めて、プランジャが自由に動くことを再チェック。
6. 他の注射器およびカプラーに中間相を転送するためにゼロμL目盛り線に組み立て混合ユニットの一方の側にプランジャーを移動します。
7. 混合ユニットから空の注射器を（代わりに、そのフェルール付き）を外し、すぐにロードされた注射器を接続する - カプラーとttached - 10μL分注シリンジのスレッド終了する。カップリングが行われるとの緊張の度合いは、すでに言及したように、非常に重要です。
8. カプラを介して中間相の転送ができるよう、100μLシリンジのプランジャーを押し下げて、調剤シリンジをロードします。
9. 調剤シリンジの鋼の終了に短く、平らな先端の針を固定し、慎重に場所でそれを締めてください。
10. グリップリングのナットを締めて、ラチェットアームにプランジャーをクランプ。注意これはそれが使用不能にプランジャーを獲得して変形できるように、ナットを締めすぎないように注意してください。クランプ状態でラチェットアームに提供される情報の範囲は、ビデオで示さインチ、以下に制限することが重要です。これを超えて、プランジャーは、座屈と配信が失敗することができる傾向を持つことになります。
11. それによって針の空隙容積を充填し、針をロード、バレルにプランジャーを進めるためにラチェットのドラムを数回握り。このステップは、中間相の連続した​​文字列は、針の先端から出てくるまで（最大10回）繰り返される必要があります。
12. いくつかのタンパク質が追加された沈殿剤なしでキュービック相で不安定であるため、結晶化の試験は、直ちに開始すべきである。

第6部：結晶化プレートを設定する

1. 表面にマルチウェル結晶化プレートとカバースリップを置き、ローディングを容易にするためのワークベンチ上に数センチを提起した。表面が少し暗いときに最適なコントラストと強化された可視性を実現している。
2. 沈殿剤のソリューションをホモジナイズし、バイアルを外す。 1μLに沈殿剤調剤のピペットを設定します。
3. 片手で垂直に開催された調剤の注射器で、中央に、直接よく番号1の塩基上記針の先端を配置するためにフリーハンドを使用してください。ガラスの表面に中間相のボーラスを追放するために繰り返しディスペンサーのボタンを押してください。ボーラス量は標準的な繰り返しディスペンサーが10 -μLシリンジで使用されている200 NLです。針の先端には、適切な配信を保証するために、ウェルのベース上に数百マイクロメートルを超えてはならない。
4. 隣接する4ウェルをメソフェーズ、2μLピペットと標準使い捨てチップを使用して、各メソボーラスの上に沈殿剤溶液の代わりに1μLがロードされた後。
5. 迅速に可能な限り、一様にそれらをカバーするために満たされた井戸を介して直角にカバースリップを配置。防水シールを有効にするには、それはスペーサーテープの露出粘着面に接触するカバースリップには押す力を加えないようにヘラを使用してください。
6. プレート上のすべてのウェルがロードされ、密封されるまで、中間相および沈殿剤ディスペンシング工程を繰り返すことができます。
7. 追跡の目的のために明らかにプレートにラベルを付けます。光感受性タンパク質は通常、インキュベーションチャンバ内に配置する前アルミ箔でプレートをラップすることによって処理されます。
8. 通常20℃、温度制御チャンバー内にプレートを置く℃に
9. 定期的なスケジュールで、10または20倍を目的とした偏光顕微鏡を用いて結晶成長のために井戸を検査。 0日目、1、2、3、5、7、14、21、30と60のセットアップ後に以下のように著者の研究室で使用されているスケジュールはありません。慎重に0.14 mm厚のサンプルの中で焦点深度を調節するメソフェーズボーラスを点検。検査は、通常の光と交差偏光子間の両方に行う必要があります。

パート7：代表的な結果

得られた結晶の外観は、膜タンパク質の本来の色、検査（またはその欠如）と照明の方法と品質のために使用される光の偏光によって変化する。図6は、いくつかの可能な結晶の外観を示しています。通常の光で見たときメソで成長して自然に着色された膜タンパク質は、図6（パネルBおよびD）に示すもののようになります。通常の光で見たとき立方相で成長している無色の膜タンパク質の結晶は、図6（パネルE）に示すもののようになります。最後に、偏光で見たときメソで成長している無色の膜タンパク質の結晶は、図6（パネルAおよびC）のようになります。

構造決定の全体的なプロセスの次のステップは、収穫し、低温冷却結晶をして、そこからX線回折を記録して分析することです。これらのトピックは個別のJoveの記事でカバーされることがあります。

図1にしている上に脂質二重層を示す生体膜の模式図は、タンパク質の様々な場所に位置しています。

図2。構造ビタミンB ₁₂の輸送蛋白質、BtuBから、MXとこのJoveの記事に示されているメソ法⁶ のことで成長した結晶を用いて解く。

図3：構造と機能のサイクルは、蛋白質についての完全な構造情報を取得し、利用に必要な手順の多くを示しています。

図4のフローチャートは、 メソ法における法による膜タンパク質結晶の生成に関与する手順をまとめます。赤い破線で囲まれたそれらのステップのみがこのJoveの記事でカバーされています。参考資料2から。

図5。脂質（モノオレイン）/水システムの簡素化温度組成相図。結晶化の試験は20に設定されています° C脂質が40％の水分補給に水で飽和する場所。詳細な相図は文献5で利用可能です。

図6。脂質中間相で成長している膜タンパク質の結晶。
（A）ビタミンB ₁₂の輸送蛋白質、BtuB ^6、（b）に集光性複合体II ^7（C）アドヘシン/インベイシンOPCA ^8、（D）バクテリオロドプシン^9、膿から（e）の炭水化物トランスポーター。画像は、通常の光（B、D、E）とし、交差した偏光子（、c）の間に記録した。

Discussion

立方相は、変数の数の変化で大幅に変更することができる繊細かつダイナミックな環境です。それはすべての潜在的な落とし穴を説明するマニュアルモードでのメソ結晶化試験でのセットアップの説明を与えることは不可能である。しかし、多くの困難は、高価なタンパク質溶液に適用する前に技法を実践し、そして混合時に注射器に加えられた圧力に調停を使うことによって回避することができます。正しく行えば、 メソの方法でタンパク質のさまざまな結晶を得ることができる、の数は絶えず増加しています。

メソ結晶化試験でのセットアップがここで与えられた説明は、マニュアルモードに焦点を当てています。プロセスはすることができ、多くの場合、結晶化条件の大規模スクリーニングを必要とするような場合には結晶化プレートの自動セットアップを容易にするために変更されます。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Protein solution	Reagent	Various	Various
Lipid (monoolein)	Reagent	Sigma-Aldrich	Various
Precipitant solutions	Reagent	Various	Various
Purified water	Reagent	EMD Millipore
Pipetting devices	Tool	Pipetman	Various
Disposable pipet tips	Disposable	Pipetman	Various
Gas-tight syringes	Tool	Hamilton Co	80265 (25-µl)
Syringe tips	Tool	Hamilton Co	7770-020 (gauge 22)
Narrow bore coupler*	Tool	Hamilton Co	various/EBS-LCP-2
Repeating dispenser	Tool	Hamilton Co	83700
Silanized glass microscope slides	Disposable	Gold Seal	3010
microscope coverslips	Disposable	Fisher Scientific	12-548C
Perforated double-stick spacer tape	Disposable	Saunders Corporation (hole-punched)	NA
Tweezers	Tool	Various	NA
Brayer (roller)	Tool	Fisher Scientific	50820937
Chipped ice	Temperature Control	N/A	NA
Tissues	Disposable	N/A	NA
Calculator	Tool	Various	NA
Lab notebook	Tool	Various	NA
* Full details for machining your own Narrow Bore Coupler are provided in Reference 3.