Kristalliserande Membrane proteiner för strukturbestämning med Lipidic Mesophases

Summary

Häri beskrivs förfarandet genomförs i Caffrey Membrane strukturella och funktionella biologi-gruppen att ställa in manuellt kristallisering studier av membranproteiner i lipidic mesophases.

Abstract

En detaljerad protokoll för kristalliserande membranproteiner med lipidic mesophases beskrivs. Denna metod har omväxlande varit kallad lipidic kubikmeter fas eller i meso metod. Metoden har visat sig vara ganska mångsidig i det att den har använts för att lösa röntgenkristallografisk strukturer av prokaryota och eukaryota proteiner, proteiner som monomer, homo-och hetero-multimeric, kromofora innehåller och kromofor-fri, och alfa -spiralformade och beta-fat proteiner. De senaste framgångarna med i meso kristallisering är den mänskliga konstruerade beta2-och adenosin A2a G-proteinkopplade receptorer. Protokoll presenteras för beredning av membranprotein i monoolein-baserade mesophase, och för upprättande av crystallizations i manuellt läge. Ytterligare steg i den övergripande processen, såsom kristall skörd, kommer att behandlas i kommande videon artiklar. Den tid som krävs för att förbereda protein-laddade mesophase och att inrätta en kristallisering tallrik manuellt är ungefär en timme.

Protocol

Ett viktigt fokus inom området för strukturella och funktionella biologi är den biologiska membran (figur 1). Membranet, som omger cellen och sub-cellulära organeller när de förekommer, är ett molekylärt tunn struktur bara två lipid molekyler över och är översållad med proteiner. Struktur och funktion som gäller för både lipider och proteiner är av intresse. Dock är fokus för denna artikel begränsad till membranproteiner.

En bättre förståelse av hur membranproteiner fungerar på molekylär nivå söks av två skäl. För det första är den intellektuella tillfredsställelse i att veta hur de fungerar. För det andra, genom att veta hur ett protein fungerar, det finns alltid möjligheten att kunna fixa det om det inte fungerar eller att förbättra eller ens ändra den för speciella applikationer. Drug design är ett tydligt resultat av denna typ av arbete. Ett sätt att räkna hur ett membranprotein fungerar på molekylär nivå är att bestämma dess struktur. Detta innebär inrättande av plats i 3-dimensionell rymd av alla atomer, eller åtminstone alla icke-väteatomer, som bygger upp protein. Den metod vi använder för detta ändamål är makromolekylära röntgenkristallografi (MX). Figur 2 visar ett exempel på ett membranprotein vars struktur bestämdes med MX. En diffraktion kvalitet kristall av proteinet är skyldig att göra MX.

Uppenbarligen finns det många steg i strukturbestämning med makromolekylära kristallografi. Detta illustreras i figur 3. Vanligtvis inkluderar dessa att identifiera ett mål membranprotein, och sedan producera, rening och kristalliserande det. Diffraktion mätningar på kristallen med hjälp av ett hem eller en synkrotron röntgen källa. Den diffraktion behandlas ger en elektrontäthet karta som sedan förses med en molekylär modell. Modellen, när raffinerat, kan användas för att utforska verkningsmekanismen av det protein och för struktur-baserade läkemedlet design.

Fokus i denna artikel är att visa hur vi producerar kristaller diffraktion kvaliteten på membranproteiner med lipidic mesophases, genom så kallade in meso-metoden. En färsk genomgång av metoden och dess omfattning finns i Referens 1 (Caffrey, 2009). Steg-för-steg-protokollet kommer vi att följa här beskrivs i referens 2 (Caffrey och Cherezov, 2009).

Ett flödesschema som sammanfattar de steg som ingår i och tid som krävs för att upprätta en meso membranprotein kristallisering studie visas i Figur 4. Denna artikel omfattar de steg som avgränsas av streckade röda linjer.

Del 1: Förbereda kristallisation Plattor

1. Placera en silaniseras objektsglas på arbetsbänk.
2. Ta bort skyddspapperet locket från en yta av en remsa av perforerad dubbel pinne avståndsband (kommersiellt tillgängliga, se tabell av särskilda reagenser och utrustning nedan).
3. Placera tejp, klibbiga sidan nedåt i kontakt med ytan på bilden.
4. Tryck-tätning bandet till bilden med hjälp av en brayer eller roller. Aluminiumfolie kan placeras mellan tejpen och rullen för att skydda basen av brunnarna.
5. Ta bort det andra papperet locket från tejpen att exponera sin övre klibbiga yta.
6. Placera enskilda silaniseras täckglas i nära anslutning till plattan för snabb och effektiv tätning av brunnar så snart lastningen är klar.

Del 2: Förbereda Lipid spruta

1. Placera lipid (ofta monoolein) i en temperatur-kontrollerad blocket vid 45 ° C i 3 minuter för att göra det smält.
2. Medan lipid smälter förbereda två 100-mikroliter gastät Hamilton sprutor för användning i lipid-protein blandning steg. Ta bort Teflon hylsan från sprutan som ska innehålla protein lösning. Lägg sprutan som kommer att hålla lipid bredvid (som lämnar sin holk på plats).
3. Anslut kopplingen (se tabell av särskilda reagenser och utrustning nedan och Referens 3 (Cheng et al. 1998)) till lipid sprutan. Dra åt kopplingen till sprutan, men inte för hårt. Ta bort kolven från fat av lipid sprutan.
4. Observera att lipid måste smälta innan du fortsätter. Ställ in pipetten till 30 mikroliter och sakta tar upp cirka 30 mikroliter av smält fett. Sakta levererar så mycket av det smälta fettet som du kan när den öppna änden av sprutan noggrann med att inte införa luftspalter.
5. Placera kolven i tunnan i kontakt med smält fett och långsamt föra kolven upp pipan med sprutan hålls vertikalt vilket framgår i videon. Luftbubblor som kan fastna misstag bör öka i processen och släppas.
6. Noggrant fastställa omfattningen av lipid i sprutan genom att läsa markeringarna på sprutan.
7. Skjut ferrmodul på nålen som sträcker sig från kopplingen. Använd kolven för att tvinga den smälta fett upp pipan och långsamt och försiktigt in nålen i kärnan av kopplingen.

Del 3: Förbereda Protein spruta

1. Proteinet Lösningen ska vara spunnet på 14.000 gi 5 till 10 minuter vid 4 ° C för att ta bort stora aggregat innan du installerar kristallisering prövningar. Ta bort protein lösning från isen och låt det utjämna till rumstemperatur.
2. Beräkna volymen av protein lösning att använda för att bilda den kubiska fasen vid eller nära fullt hydrering. För monoolein vid 20 ° C, full hydrering med vatten sker vid nära 40% vatten (vikt) som i fas diagram ⁵ (Figur 5).
3. Med en 25 eller 50 mikroliter Hamilton spruta tar upp den volym av protein lösning. Överför lösningen på Teflon toppen av kolven i tunnan av proteinet sprutan noga med att undvika luftbubblor.
4. Försiktigt dra tillbaka nålen och mäta volymen av protein lösning i sprutan. Det bör matcha värdet levereras i föregående steg.
5. Sakta tums proteinet lösningen upp pipan att sluta spola med dess öppna slut.
6. Skruva proteinet sprutan i den öppna änden av kopplet fäst vid lipid sprutan. Det är viktigt att enheten inte alltför skärpas. Över-åtdragning de församlade Blandningsanordningen i detta skede kommer att skada skoningar och orsaka läckage. Under-åtdragning kommer också att leda till läckage.

Del 4: Blandning Protein Solution och Lipid: Göra Mesophase

1. För att verkställa blandning förskott kolven på proteinet sidan av de församlade Shunten till sin gräns, med tummen eller pekfingret kör proteinet lösningen ur proteinet sprutan genom kopplingen och in i lipid sprutan.
2. Kolven på lipid sidan nu används för att driva innehållet i lipid sprutan tillbaka genom kopplingen och in i proteinet sprutan.
3. Processen upprepas många gånger, ibland, är en hundra stycken eller mer krävs för att producera en homogen mesophase. I början av blandning, kan förflyttning av materialet fram och tillbaka genom kopplingen vara ojämn och ibland är extra kraft som behövs för att åstadkomma blandning. Inledande blandning brukar åtföljas av utvecklingen av en icke-enhetlig grumlighet i provet. Som homogenisering fortskrider, blir strukturen mer enhetlig och karakteristiska för viskösa kubiska fasen, liksom utseendet på den framväxande kubikmeter mesophase.
4. Om förhållandena är lämpliga och kubiska former fasen, bör spridningen visas optiskt genomskinliga i sprutan. Därför bör markeringarna på sprutan vara lättlästa genom mesophase i pipan.
5. Mycket liten kylning av provet under blandning genom att placera sprutans mixer för en kort tid på isen kan påskynda homogenisering och uppnåendet av öppenhet. Det är dock viktigt att inte kyls provet.
6. Försiktighet bör vidtas för att undvika extremt kraftfull blandning, eftersom detta kan orsaka provets temperatur att stiga på grund av friktion värme ^3.

Del 5: Ladda Dispenser

1. Ta bort nålen och kolven från en 10-mikroliter Hamilton spruta. Lämna teflon hylsan på plats.
2. Ta bort muttern från dispensern med hjälp av ett litet mynt.
3. Med spärrnyckel armen fullt ut och för in sprutan - utan dess kolv och nål - genom att hålla ringen av dispensern.
4. Byt behålla mutter, packning vänd sprutan, och skruva fast den ordentligt på den öppna änden av sprutan.
   Försiktighet bör vidtas för att säkerställa att sprutan är ordentligt centrerad i innehavet ringen och att pipan är i linje parallell med spärrnyckel armen. Båda kan dömas av ögat. Dessa två krav är avgörande för att undvika läckage.
5. Passera kolven genom gripande ringen med gripdonet muttern skruvas några varv och styra kolven i den öppna änden av sprutan. Tryck in spärrnyckel armen fullt. Flytta kolven i tunnan och kontrollera att den färdas fritt och sant i den fat. Det kan hjälpa att lossa skruven på svärdet för att underlätta kolven röra sig fritt. Se till att det gör det. Tryck in kolven tills dess teflon spets sammanfaller med noll mikroliter graderingen på fat. Om skruven på svärdet var lossnat, dra åt den och kontrollera igen att kolven går fritt.
6. Flytta kolven på ena sidan av de församlade Shunten till noll mikroliter graderingen att överföra mesophase till den andra sprutan och kopplingen.
7. Koppla bort den tomma sprutan (med dess hylsa på plats) från Shunten och omedelbart ansluta laddade sprutan - med kopplingen enttached - att den gängade uppsägning av 10-mikroliter dispensering spruta. Graden av täthet med vilken kopplingen är gjort är kritisk, vilket redan konstaterats.
8. Ladda utlämning sprutan genom intryckning av kolven i den 100-mikroliter spruta så att mesophase överföringar genom kopplingen.
9. Säkra kort, platt spets nål till stål uppsägning av utlämning sprutan och försiktigt dra den på plats.
10. Kläm in kolven till spärrnyckel armen genom att dra åt muttern i gripande ringen. Försiktighet bör iakttas att inte över-dra åt muttern, eftersom detta kan göra mål och deformera kolven gör den obrukbar. Det är viktigt att resa intervallet ges till ratchet armen i fastspänd tillståndet begränsas till inte mer än en tum, vilket visas i videon. Utöver detta kommer kolven ha en tendens att spänne och leverans kan misslyckas.
11. Tryck in spärr trumman flera gånger för att föra kolven i tunnan, och därmed fylla hålrumsvolym nålen och lastning nålen. Detta steg bör upprepas (upp till tio gånger) tills en kontinuerlig sträng av mesophase framgår av nålspetsen.
12. Kristallisering försök bör inledas omedelbart, som vissa proteiner är instabila i kubik fas utan tillsatt fällningsmedel.

Del 6: Ställa in Crystallization Plattor

1. Placera en multi-och kristallisering tallrik och täckglas på en yta upp några inches ovanför arbetsbänken för att underlätta lastning. Optimal kontrast och ökad synlighet uppnås när ytan är något mörka.
2. Homogenisera fällningsmedel lösningar och Ta bort skyddet från injektionsflaskorna. Ställ fällningsmedel dosering pipett till 1 mikroliter.
3. Med utlämning sprutan hålls vertikalt i ena handen, använda den fria handen för att placera nålspetsen i centrum och direkt ovanför botten av väl nummer 1. Tryck på knappen på den upprepade dispenser att utvisa en bolusdos av mesophase på glasytan. Den bolus Volymen är 200 nL när standarden upprepa dispensern används med ett 10-mikroliter spruta. Den nålspetsen bör inte vara mer än några hundra mikrometer över basen av väl för att säkerställa korrekt leverans.
4. Efter 4 intilliggande brunnar är laddade med mesophase, placera en mikroliter av fällningsmedel lösning på toppen av varje mesophase bolus med hjälp av en 2-mikroliter pipett och standard engångsspetsar.
5. Så snabbt som möjligt, placera ett täckglas rakt över den fyllda brunnar att täcka dem jämnt. För att verkställa en vattentät försegling, använder en spatel att utöva påtryckningar på täckglas där den får kontakt med den exponerade klibbiga yta avståndsband.
6. Den mesophase och fällningsmedel dispensering process kan upprepas tills alla brunnar på tallriken fylls och förseglas.
7. Etikett plattan klart för uppföljning. Ljuskänsliga proteiner vanligtvis hanteras genom att linda plattorna i aluminiumfolie innan du lägger dem i inkubation kammaren.
8. Placera plattorna i en temperaturkontrollerad kammare, vanligtvis vid 20 ° C.
9. På ett regelbundet schema, inspektera brunnarna i kristallen tillväxt med hjälp av ett polariserat ljusmikroskop med en 10 eller 20-faldig mål. Schemat används i författarens labbet är följande: dag 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 och 60 post-setup. Försiktigt inspektera mesophase bolus justera skärpedjup inom 0,14 mm tjock prov. Undersökning bör göras både i normalt ljus och mellan överkorsade polarisatorer.

Del 7: representativa resultat

Utseendet på den resulterande kristallerna varierar med inneboende färgen på membranprotein, den polarisering av ljus som används för kontroll (eller brist därav) och metoden och kvaliteten på belysning. Figur 6 visar flera möjliga kristall framträdanden. Naturligtvis färgat membranproteiner som växer i meso när de ses med vanligt ljus kan se ut som visas i figur 6 (Paneler b och d). Färglösa membranprotein kristaller som växer i kubik fas när de ses med vanligt ljus kan se ut som visas i figur 6 (Panel e). Slutligen kan färglösa membranprotein kristaller som växer i meso när de ses med polariserat ljus ser ut som figur 6 (Paneler a och c).

Nästa steg i den övergripande processen för strukturbestämning är att skörda och Cryo-cool kristallerna och att registrera och analysera röntgendiffraktion från dem. Dessa frågor kommer att behandlas i separata JUPITER artiklar.

Figur 1. Schematisk bild av ett biologiskt membran som visar membranet i och på vilken ligger en mängd olika proteiner.

Figur 2. Strukturenav vitamin B ₁₂ transporterande protein, BtuB, lösas med MX och kristaller odlas av den i meso-metoden ⁶ illustreras i detta JUPITER artikeln.

Figur 3. Struktur och funktion cykel illustrerar många av de steg som ingår i att erhålla och utnyttja alla strukturella information om ett protein.

Figur 4. Flödesschemat sammanfattar de olika stegen i tillverkningen av kristaller membranprotein som i meso-metoden. Endast de steg som omges av den streckade röda linjen behandlas i detta JUPITER artikeln. Från Referens 2.

Figur 5. Förenklad temperatur-komposition fasdiagram för lipider (monoolein) / vatten-systemet. Kristallisering försök sätts upp vid 20 ° C där lipid mättade med vatten i 40% hydrering. Den detaljerade fasdiagram finns i Reference 5.

Figur 6. Kristaller av membranproteiner som växer i lipidic mesophase.
(A) vitamin B ₁₂ transporterande protein, BtuB ^6, (b) komplex II ⁷ ljus-skörd, (c) adhesin / invasin ⁸ OPCA, (d) ⁹ bacteriorhodopsin, (e) en kolhydrat transportör från Pseudomonas. Bilder inspelade med vanligt ljus (b, d, e) och mellan korsade polarisatorer (a, c).

Discussion

Den kubiska fasen är en känslig och dynamisk miljö som kan förändras drastiskt med ändring av ett antal variabler. Det är inte möjligt att ge en beskrivning av installationen av i meso kristallisering försök i det manuella läget som beskriver alla potentiella fallgropar. Däremot kan många svårigheter undvikas genom tillämpning av tekniken innan det till dyra protein lösningar och genom att använda måttliga tryck appliceras på sprutor under omrörning. Görs på rätt sätt, kan i meso-metoden ger kristaller av en mängd olika proteiner, är antalet som ökar konstant.

Den beskrivning som ges här av installationen av i meso kristallisering studier fokuserar på det manuella läget. Processen kan vara, och ofta har ändrats för att underlätta automatisk inställning av kristallisation plattorna i de fall som kräver storskalig screening av kristallisering villkor.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Protein solution	Reagent	Various	Various
Lipid (monoolein)	Reagent	Sigma-Aldrich	Various
Precipitant solutions	Reagent	Various	Various
Purified water	Reagent	EMD Millipore
Pipetting devices	Tool	Pipetman	Various
Disposable pipet tips	Disposable	Pipetman	Various
Gas-tight syringes	Tool	Hamilton Co	80265 (25-µl)
Syringe tips	Tool	Hamilton Co	7770-020 (gauge 22)
Narrow bore coupler*	Tool	Hamilton Co	various/EBS-LCP-2
Repeating dispenser	Tool	Hamilton Co	83700
Silanized glass microscope slides	Disposable	Gold Seal	3010
microscope coverslips	Disposable	Fisher Scientific	12-548C
Perforated double-stick spacer tape	Disposable	Saunders Corporation (hole-punched)	NA
Tweezers	Tool	Various	NA
Brayer (roller)	Tool	Fisher Scientific	50820937
Chipped ice	Temperature Control	N/A	NA
Tissues	Disposable	N/A	NA
Calculator	Tool	Various	NA
Lab notebook	Tool	Various	NA
* Full details for machining your own Narrow Bore Coupler are provided in Reference 3.