Summary
Здесь описывается процедура осуществляется в мембранных Кэффри Структурно-функциональная биологии Группа настроить вручную кристаллизации испытания мембранных белков в липидных мезофаз.
Abstract
Подробный протокол для кристаллизации мембранных белков с помощью липидных мезофаз описано. Этот метод имеет разному упоминается как липидный кубической фазе или в методе мезо. Метод был показан довольно универсальны в том, что она была использована для решения рентгеноструктурный структуры прокариотических и эукариотических белков, белки, которые являются мономерные, гомо-и гетеро-мультимерные, хромофор-содержащих и хромофора-свободной, и альфа- -спиральных и бета-баррель белков. Недавние успехи в использовании кристаллизации мезо являются человеческой инженерии бета2-адренорецепторов и аденозин A2a G-белком рецепторы. Протоколы представляются для восстановления мембранного белка в моноолеина основе мезофазы, а также для создания кристаллизации в ручном режиме. Дополнительные шаги в рамках общего процесса, такие, как кристалл уборки, должны быть рассмотрены в следующих статьях видео. Время, необходимое для подготовки белка загружены мезофазы и создать кристаллизации пластины вручную составляет около одного часа.
Protocol
Важным направлением в области структурных и функциональных биология биологические мембраны (рис. 1). Мембрана, которая окружает клетки и субклеточных органелл, когда он присутствует, молекулярно тонкой структуры только две молекулы липидного поперек и усеяна белки. Структура и функции применительно к обоим липидов и белков, представляющих интерес. Тем не менее, тема этой статьи ограничен мембранных белков.
Лучше понять, как мембранные белки функции на молекулярном уровне ищется по двум причинам. Во-первых, интеллектуальное удовлетворение, зная, как они работают. Во-вторых, зная, как белка работы, всегда есть перспектива быть в состоянии исправить это должно неисправности или улучшения или даже модифицировать его для конкретных приложений. Наркотиками дизайн очевидным результат этого вида работ. Один из подходов к вычислять как мембранный белок работает на молекулярном уровне, чтобы определить его структуру. Это предполагает установление места в 3-мерном пространстве всех атомов, или, по крайней мере, все без атомов водорода, которые составляют белки. Метод мы используем для этой цели макромолекулярных рентгеновской кристаллографии (MX). На рисунке 2 показан пример мембранный белок, структура которого определяется с использованием MX. Кристаллов дифракционных качество белка требуется сделать MX.
Очевидно, Есть много этапов определения структуры использования кристаллографии макромолекул. Это показано на рисунке 3. Как правило, эти включают в себя определение целевой мембранный белок, а затем производства, очистки и кристаллизации его. Дифракционные измерения проводятся на кристалл использования дома или синхротронного рентгеновского источника. Дифракционные данные обрабатываются уступая карту электронной плотности, которая затем устанавливается с молекулярной модели. Модели, когда изысканный, могут быть использованы для изучения механизма действия белка и для структуры разработки на основе препарата.
В центре внимания данной статьи является показать, как мы производим дифракции качество кристаллов мембранных белков на липидный мезофазы, по так называемым методом в мезо. Недавний обзор метода и область ее применения, содержится в источнике 1 (Кэффри, 2009). Шаг за шагом протокола мы будем следовать здесь описывается в ссылке 2 (Кэффри и Черезов, 2009).
Блок-схема кратко этапы и время, необходимое для установки в мезо мембраны суда кристаллизации белков показано на рисунке 4. В данной статье рассматриваются эти шаги заключены в красной пунктирной линии.
Часть 1: Подготовка Кристаллизация Плиты
- Позиция silanized слайд микроскоп на верстаке.
- Снимите защитную крышку бумаги от одной поверхности полосы перфорированные ленты двойной Spacer палку (в продаже, см. таблицу специфических реактивов и оборудования ниже).
- Место ленты, липкой стороной вниз, при контакте с поверхностью слайда.
- Давление уплотнения ленты слайд с помощью осел или валиком. Алюминиевая фольга может быть помещен между лентой и роликом для защиты базы скважин.
- Удалите вторую крышку бумаги из ленты подвергать его верхней липкой поверхностью.
- Место отдельных silanized покровных в непосредственной близости от пластины для быстрой и эффективной герметизации скважины, как только загрузка будет завершена.
Часть 2: Подготовка липидов Шприц
- Место липидов (часто моноолеина) в контролируемой температурой блока при 45 ° С в течение 3 минут, чтобы сделать ее расплавленным.
- Хотя липидного тает подготовить два 100-мкл газонепроницаемые Гамильтон шприцы для использования в липид-белковых стадии смешения. Удалить тефлоновым наконечником из шприца, который будет содержать белок решение. Место шприца, который будет содержать липидные рядом с ним (оставляя его наконечник на месте).
- Подключите переходник (см. таблицу специфических реактивов и оборудования ниже, и Ссылка 3 (Cheng и соавт., 1998)) в липидных шприц. Finger затянуть переходник для шприца, но не затягивайте. Удалите поршень из ствола липидного шприц.
- Обратите внимание, что липидные должна быть расплавленной прежде чем продолжить. Установить пипетки на 30 мкл и медленно занимают примерно 30 мкл расплавленного липидов. Медленно доставить как можно больше расплавленной липидной, как вы можете в открытый конец шприца осторожно, чтобы не ввести воздушные зазоры.
- Место поршень в ствол в контакте с расплавленным липидов и медленно продвигаться плунжера бочку с шприц в вертикальном положении, как показано в видео. Пузырьки воздуха, которые могут попасть случайно должен вырасти в этом процессе и быть освобожден.
- Тщательно определения объема липидов в шприц, прочитав маркировку на шприц баррель.
- Слайд FERRULE на иглу простирается от муфты. Используйте поршень, чтобы заставить расплавленной липидной до ствола и медленно и осторожно в иглу в центре муфты.
Часть 3: Подготовка белка Шприц
- Раствора белка должна вращаться при 14000 г в течение 5 до 10 минут при температуре 4 ° С для удаления крупных агрегатов до создания кристаллизации испытаний. Удалить раствора белка из льда и дать ему уравновешивания при комнатной температуре.
- Рассчитайте объем раствора белка использовать для формирования кубической фазы на уровне или близко к полной гидратации. Для моноолеина при 20 ° С, полной гидратации с водой происходит при близких к 40% воды (по массе), как в диаграмме 5 (рис. 5).
- С 25 или 50 мкл шприце Hamilton занять необходимый объем раствора белка. Перенесите раствор на кончик тефлон из поршень в стволе белка шприц избегая пузырьков воздуха.
- Аккуратно извлеките иглу и измеряют объем белкового раствора в шприце. Она должна соответствовать значению поставлен в предыдущем шаге.
- Медленно дюймовый раствора белка до баррель в конечном итоге на одном уровне с его открытый конец.
- Винт белка шприца в открытый конец муфты придается липидного шприц. Очень важно, чтобы устройство не быть чрезмерно затягивается. За затягивание собраны смесительного устройства на данном этапе может привести к повреждению наконечники и вызвать течь. Заместитель ужесточение также приведет к утечке.
Часть 4: Смешивание раствора белка и липидов: Создание мезофазы
- Чтобы эффект смешивания, заранее поршень на белок стороне собранный смеситель до предела, с большим или указательным пальцем вождения раствора белка из белка шприц, через переходник и в липидных шприц.
- Поршень на липидный сторона в настоящее время используется для управления содержанием липидного шприц обратно через переходник и в белок шприц.
- Процесс повторяется много раз, иногда, сто мест и более, необходимых для производства однородной мезофазы. В начале перемешивания, движения материальных и обратно через ответвитель может быть неравномерным и, порой, дополнительную силу необходимо, чтобы эффект смешивания. Первоначальные смешивания обычно сопровождается развитием неоднородных облачности в образце. Как гомогенизации прогрессирует, текстура становится более равномерным и характеристики вязкого кубической фазы, как и внешний вид новых кубических мезофазы.
- Если условия будут уместны и кубические формы фазы, дисперсии должно появиться оптически прозрачный в шприце баррель. Таким образом, маркировка на шприца должен быть четким через мезофазы в бочке.
- Очень небольшое охлаждение образца во время смешивания, помещая шприц смесителя в течение короткого времени на льду может ускорить унификацию и достижение прозрачности. Тем не менее, важно не переохлаждаться образца.
- Следует проявлять осторожность, чтобы избежать чрезвычайно интенсивное перемешивание, так как это может привести к температуре образца расти в связи с фрикционного нагрева 3.
Часть 5: Загрузка диспенсер
- Удалите иглу и поршень из 10-мкл шприца Гамильтона. Оставьте тефлоновым наконечником на месте.
- Снимите гайку из колонки с помощью небольшой монеты.
- С храповым рука полностью выведены, вставьте шприц - без его поршень и игла - через проведение кольцо распылителя.
- Заменить гайку, прокладка стороной шприц, и закрепите его в плотно на открытый конец шприца.
Следует проявлять осторожность, чтобы обеспечить шприца правильно с центром в проведении кольцо и что ствол выравнивается параллельно храповиком руку. Как можно судить на глаз. Эти два требования являются критическими, чтобы избежать утечки. - Пропустите через поршень захвата кольцо с захватом гайку отвинтить несколько оборотов и направлять поршень в открытый конец шприца. Нажмите храповиком руки в полном объеме. Переместите поршень в ствол и убедитесь, что он проходит свободно и справедливо баррель. Это может помочь ослабить винт на шины для облегчения поршень движется свободно. Убедитесь, что он делает. Нажмите на поршень, пока его тефлоновым наконечником совпадет с нуля мкл знак окончания на баррель. Если винт на бар руководство было ослаблены, затяните его и перепроверить, что поршень движется свободно.
- Перемещение плунжера на одной стороне собран смеситель с нуля мкл знак окончания передачи мезофазы с другой шприц и муфты.
- Отсоедините пустой шприц (с наконечником на месте) от смесительного агрегата и сразу же подключить загружены шприц - с ответвительttached - на резьбовые окончания 10-мкл шприца дозатора. Степень герметичности, с которой осуществляется связь имеет решающее значение, как уже отмечалось.
- Нагрузка дозирования шприц, нажав на поршень 100-мкл шприц так, чтобы мезофазы переводы через переходник.
- Безопасные короткие, телевизор с плоским наконечником иглы стали прекращение шприц для дозирования и тщательно закрепите его на месте.
- Зажим поршень для трещотки руку, затянув гайки в захватывающий кольцо. Следует проявлять осторожность, чтобы не затягивайте гайки, так как это может забить и деформировать поршень, что делает его непригодным для использования. Важно, что диапазон перемещения предоставлена храповиком руке зажат в условиях ограничиваться не более чем на дюйм, как показано в видео. Помимо этого, поршень будет иметь тенденцию к пряжке и доставка может потерпеть неудачу.
- Нажмите храповиком барабан несколько раз, чтобы заранее поршень в цилиндре, тем самым заполняя свободном объеме иглы и загрузка иглы. Этот шаг следует повторять (до десяти раз), пока непрерывная цепь мезофазы выходит из кончика иглы.
- Кристаллизация испытания должны начаться немедленно, так как некоторые белки являются неустойчивыми в кубической фазе без добавления осадителя.
Часть 6: Настройка Кристаллизация Плиты
- Место мульти-луночного планшета кристаллизации и покровное на поверхность подняты на несколько сантиметров выше верстак для удобства погрузки. Оптимальный контраст и улучшения видимости достигаются тогда, когда поверхность немного темнее.
- Однородный осадителя решения и открывать флаконы. Установить осадителя пипетки дозирования до 1 мкл.
- С шприц дозирования в вертикальном положении в одной руке, использовать свободную руку в положение иглы в центре, а непосредственно над основанием и номером 1. Нажмите кнопку на повторяющиеся диспенсер изгнать болюс мезофазы на поверхности стекла. Болюсного объем 200 нл, когда стандартные повторяющиеся диспенсер используется с 10-мкл шприц. Кончике иглы должна быть не более нескольких сотен микрометров над основанием и для обеспечения надлежащей доставки.
- После 4-х соседних скважин загружаются с мезофазы, 1 место мкл осадителя решения друг на мезофазы болюсного использованием 2-мкл пипетки и стандартные одноразовые наконечники.
- Как можно скорее, место покровное прямо над заполнены скважин, чтобы покрыть их равномерно. Для осуществления водонепроницаемое уплотнение, используйте лопаточку, чтобы оказать давление на покровное, где он вступает в контакт с обнаженной липкой поверхности прослойки ленты.
- Мезофазы и осадителя процесс выдачи может быть повторен, пока все скважины на пластине будут загружены и опечатаны.
- Этикетка пластины четко для отслеживания. Светочувствительный белков, как правило, обрабатываются упаковки пластин в алюминиевую фольгу перед помещением их в инкубационной камере.
- Место пластин в контролируемой температурой камеры, как правило, при 20 ° C.
- На регулярной, осмотрите скважин для роста кристаллов использованием поляризованной световой микроскоп с 10 или 20-кратное цели. График, используемые в лаборатории автора заключается в следующем: 0 дней, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 и 60 после установки. Внимательно осмотрите мезофазы болюсного настройки глубины резкости в пределах 0,14-мм образца. Экспертиза должна осуществляться как в обычном свете и между скрещенными-поляризаторов.
Часть 7: Представитель Результаты
Появление в результате кристаллы будут меняться в зависимости от присущих цвет мембранный белок, поляризация света, используемого для проверки (или их отсутствие), а также способ и качество освещения. На рисунке 6 показано несколько возможных выступлений кристалла. Естественно цветные мембранных белков, растущих в мезо, если смотреть с нормальным свет может выглядеть так, как показано на рисунке 6 (панели б, г). Бесцветный мембранных белковых кристаллов, растущих в кубической фазе, если смотреть с нормальным свет может выглядеть так, как показано на рисунке 6 (группа E). Наконец, бесцветный мембранный белок, кристаллы растут в мезо, если смотреть с поляризованным светом может выглядеть как на рисунке 6 (панели и с).
Следующие шаги в общий процесс определения структуры являются для сбора и крио-прохладный кристаллов и для записи и анализа дифракции рентгеновских лучей от них. Эти темы должны быть охвачены в отдельных статьях Юпитер.
Рисунок 1. Схематическое изображение биологической мембраны показывает липидного бислоя в и на которых расположены разнообразные белки.
Рисунок 2. Структураиз витамина B 12 транспортировки белков, BtuB, решается с помощью MX и кристаллов, выращенных по методу в мезо-6, приведенных в этом Юпитер статьи.
Рисунок 3. Структурно-функциональных цикл иллюстрирует многие шаги, связанные с получением и использованием полную структурную информацию о белке.
Рисунок 4. Блок-схема обобщает этапы производства кристаллов белка мембраны в методе мезо. Только эти шаги окруженные красной пунктирной линии были рассмотрены в этой статье Юпитер. С Ссылка 2.
Рисунок 5. Упрощенной температура-состав фазовой диаграммы для липидов (моноолеина) / водной системы. Кристаллизация испытаний создаются при 20 ° С, где липидного насыщения водой на 40% гидратации. Подробная схема фазы в источнике 5.
Рисунок 6. Кристаллы мембранных белков, растущих в липидной мезофазы.
() Витамина В 12 транспортировки белков, BtuB 6, (б) светособирающего комплекса II 7, (в) адгезина / invasin OPCA 8, (г) бактериородопсина 9, (е) углеводов транспортер из Pseudomonas. Изображения, записанные с обычным светом (б, г, д), а также между скрещенными поляризаторами (а, с).
Discussion
Кубической фазы является деликатной и динамичной среде, которая может существенно меняться с изменением числа переменных. Это не возможно, чтобы дать описание настройки в мезо кристаллизации испытания в ручном режиме, описывающий все возможные ловушки. Тем не менее, многие трудности можно избежать, практикуя техники перед нанесением его на дорогостоящие решения белок и с помощью умеренность в давление на шприцы в процессе перемешивания. Совершено правильно, в методе мезо может дать кристаллы различных белков, количество которых постоянно растет.
Описание здесь настройки в испытаниях мезо кристаллизации ориентирован на ручной режим. Процесс может быть, и часто изменяется, чтобы облегчить автоматизированные установки кристаллизации пластин в тех случаях, когда требуется крупномасштабное обследование условий кристаллизации.
Acknowledgments
Есть многие, кто вклад в эту работу, и большинство из мембранных Кэффри Структурно-функциональная группа биологии, как прошлого, так и нынешних членов. Чтобы все мы выражаем сердечную благодарность и признательность. Эта работа была частично поддержана грантами фонда науки Ирландии (07/IN.1/B1836), Национального института здоровья (GM75915) и Университета Лимерика.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein solution | Reagent | Various | Various | |
| Lipid (monoolein) | Reagent | Sigma-Aldrich | Various | |
| Precipitant solutions | Reagent | Various | Various | |
| Purified water | Reagent | EMD Millipore | ||
| Pipetting devices | Tool | Pipetman | Various | |
| Disposable pipet tips | Disposable | Pipetman | Various | |
| Gas-tight syringes | Tool | Hamilton Co | 80265 (25-µl) | |
| Syringe tips | Tool | Hamilton Co | 7770-020 (gauge 22) | |
| Narrow bore coupler* | Tool | Hamilton Co | various/EBS-LCP-2 | |
| Repeating dispenser | Tool | Hamilton Co | 83700 | |
| Silanized glass microscope slides | Disposable | Gold Seal | 3010 | |
| microscope coverslips | Disposable | Fisher Scientific | 12-548C | |
| Perforated double-stick spacer tape | Disposable | Saunders Corporation (hole-punched) | NA | |
| Tweezers | Tool | Various | NA | |
| Brayer (roller) | Tool | Fisher Scientific | 50820937 | |
| Chipped ice | Temperature Control | N/A | NA | |
| Tissues | Disposable | N/A | NA | |
| Calculator | Tool | Various | NA | |
| Lab notebook | Tool | Various | NA | |
* Full details for machining your own Narrow Bore Coupler are provided in Reference 3. |
||||
References
- Caffrey, M. Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases. Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases. Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
- Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21, 223-234 (2000).
- Cherezov, V. In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution. J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).
- Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases. J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).
- Cherezov, V. In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin. Proteins. 71, 24-34 (2008).
- Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).
