Summary
Hierin wordt beschreven de procedure geïmplementeerd in de Caffrey Membrane Structurele en Functionele Biologie Groep handmatig in te stellen tot kristallisatie onderzoeken van membraaneiwitten in lipide mesofasen.
Abstract
Een gedetailleerd protocol voor het kristalliseren van membraaneiwitten door gebruik te maken lipidische mesofasen wordt beschreven. Deze methode is op verschillende manieren wordt aangeduid als de lipidische kubieke fase of in meso-methode. De methode is aangetoond dat het heel veelzijdig in dat het is gebruikt om de X-ray kristallografische structuren van prokaryote en eukaryote eiwitten, eiwitten die monomere, homo-en hetero-multimere, chromofoor-bevattende en de chromofoor-vrij op te lossen, en alfa -helix en beta-vat eiwitten. Recente successen met behulp van in meso kristallisatie zijn de menselijke ontworpen beta2-adrenerge en adenosine A2a G-eiwit gekoppelde receptoren. Protocollen worden gepresenteerd voor het bereiden van de membraaneiwit in de monoolein-based mesofase, en voor het opzetten van kristallisaties in de handmatige modus. Extra stappen in het totale proces, zoals kristal oogsten, moeten worden aangepakt in de toekomst video artikelen. De tijd die nodig is om het eiwit geladen mesofase te bereiden en het opzetten van een kristallisatie-plaat handmatig is ongeveer een uur.
Protocol
Een belangrijk aandachtspunt op het gebied van structurele en functionele biologie is de biologische membraan (figuur 1). Het membraan, die de cel en sub-cellulaire organellen indien aanwezig omringt, is een moleculair dunne structuur slechts twee lipide moleculen door en is bezaaid met eiwitten. Structuur en functie, zoals toegepast op zowel de lipide en eiwitten van belang zijn. Echter, is de focus van dit artikel beperkt tot membraaneiwitten.
Een beter begrip van de manier waarop membraaneiwitten functie op een moleculair niveau wordt gevraagd om twee redenen. Ten eerste is er de intellectuele voldoening om te weten hoe ze werken. Ten tweede, door te weten hoe een eiwit werkt, is er altijd het vooruitzicht te kunnen repareren moet het storing of zelfs te verbeteren of aanpassen van het voor specifieke toepassingen. Drug design is een voor de hand liggende uitkomst van dit soort werk. Een benadering om het uitzoeken hoe een membraaneiwit werkt op moleculair niveau is om te bepalen de structuur. Dit houdt in tot oprichting van de locatie in 3-dimensionale ruimte van alle atomen, of in ieder geval alle niet-waterstofatomen, die deel uitmaken van het eiwit. De methode die wij gebruiken voor dit doel is macromoleculaire X-ray kristallografie (MX). Figuur 2 toont een voorbeeld van een membraan eiwit waarvan de structuur werd bepaald met behulp van MX. Een diffractie kwaliteit kristal van het eiwit is nodig om MX doen.
Het is duidelijk, er zijn veel stappen in de structuur bepalen met behulp van macromoleculaire kristallografie. Dit wordt geïllustreerd in figuur 3. Typisch, deze omvatten het identificeren van een membraaneiwit doel, en dan produceren, zuiveren en kristalliseren het. Diffractie metingen worden uitgevoerd op het kristal met behulp van een woning of een synchrotron X-ray source. De diffractie gegevens worden verwerkt waardoor een elektronendichtheid kaart, die vervolgens wordt voorzien van een moleculair model. Het model, wanneer verfijnd, kan worden gebruikt om het werkingsmechanisme van het eiwit te verkennen en voor het structure-based drug design.
De focus van dit artikel is te laten zien hoe we diffractie kwaliteit kristallen van membraan eiwitten met behulp van lipide mesofasen te produceren, door de zogenaamde in meso-methode. Een recent overzicht van de methode en het toepassingsgebied is verkrijgbaar in Referentie 1 (Caffrey, 2009). De stap-voor-stap-protocol zullen we hier volgen is beschreven in referentie 2 (Caffrey en Cherezov, 2009).
Een stroomschema een overzicht van de stappen die betrokken zijn bij en de tijd die nodig is voor het opzetten van een in meso membraaneiwit kristallisatie proces is weergegeven in figuur 4. Dit artikel heeft betrekking op die stappen omsloten door onderbroken rode lijnen.
Deel 1: Voorbereiden van de Kristallisatie Platen
- Plaats een gesilaniseerd microscoopglaasje op de werkbank.
- Verwijder het beschermende papier deksel van een oppervlak van een strook van geperforeerde dubbele stok spacer tape (in de handel verkrijgbaar, zie Tabel van specifieke reagentia en apparatuur hieronder).
- Naar beneden plaats de tape, plakkerige zijde, in contact met het oppervlak van de dia.
- Druk-seal de tape aan de dia met behulp van een Brayer of roller. Aluminiumfolie kan worden geplaatst tussen de band en de roller aan de basis van de putten te beschermen.
- Verwijder het tweede paper deksel van de tape in de bovenste plakkerig oppervlak bloot te leggen.
- Plaats individuele gesilaniseerd dekglaasjes in de nabijheid van de plaat voor een snelle en efficiënte afdichting van putten, zodra het laden is voltooid.
Deel 2: Voorbereiden van de Lipid spuit
- Plaats de lipide (vaak monoolein) in een temperatuur-gecontroleerde blok bij 45 ° C gedurende 3 minuten te maken is gesmolten.
- Terwijl de lipide aan het smelten is voor te bereiden twee 100-pi gasdichte Hamilton spuiten voor gebruik in de lipide-eiwit mengen stap. Haal de teflon beentje van de spuit, dat het eiwit-oplossing zal bevatten. Plaats de spuit die de lipide zal houden ernaast (het verlaten van de huls op zijn plaats).
- Verbind de koppeling (zie Tabel van specifieke reagentia en apparatuur hieronder en referentie 3 (Cheng et al.., 1998)) om de lipide spuit. Vinger Draai de koppeling aan de spuit, maar niet te strak aandraaien. Verwijder de zuiger uit de loop van de lipide spuit.
- Merk op dat de lipide moet zijn gesmolten voordat u verder gaat. Zet de pipet op 30 pi en langzaam nemen ongeveer 30 pi van gesmolten lipide. Langzaam leveren als een groot deel van het gesmolten lipide als je kunt in het open uiteinde van de spuit zorg niet te luchtspleten te introduceren.
- Plaats de zuiger in het vat in contact met het gesmolten lipide en langzaam de zuiger van tevoren op het vat met de spuit verticaal gehouden zoals blijkt in de video. Luchtbellen die per ongeluk kan worden gevangen moeten stijgen in het proces en worden vrijgegeven.
- Zorgvuldig bepalen van het volume van lipiden in de spuit door het lezen van de markeringen op de spuit.
- Schuif de ferrule op de naald zich uitstrekt van de koppeling. Gebruik de zuiger om het gesmolten lipide opdrijven het vat en langzaam en voorzichtig in de naald in de kern van de koppeling.
Deel 3: Voorbereiden van de Protein spuit
- Het eiwit oplossing dient te worden gecentrifugeerd bij 14.000 g gedurende 5 tot 10 minuten bij 4 ° C om grote aggregaten te verwijderen voordat u kristallisatie onderzoeken. Verwijder het eiwit-oplossing van het ijs en laat hem in evenwicht bij kamertemperatuur.
- Bereken het volume van de eiwit-oplossing te gebruiken om de kubieke fase bij te vormen of om volledige hydratatie te sluiten. Voor monoolein bij 20 ° C, volledige hydratatie met water treedt op bij bijna 40% water (massa) als in de fase diagram 5 (figuur 5).
- Met een 25 of 50 pL Hamilton spuit nemen van de benodigde hoeveelheid eiwit-oplossing. Breng de oplossing op de Teflon uiteinde van de zuiger in de loop van het eiwit spuit zorg om luchtbellen te voorkomen.
- Voorzichtig te trekken van de naald en meet het volume van de eiwit-oplossing in de spuit. Het moet overeenkomen met de waarde geleverd in de vorige stap.
- Langzaam inch van de eiwit-oplossing tot het vat om uiteindelijk spoelen met zijn open einde.
- Schroef het eiwit spuit in het open uiteinde van de koppeling aan de lipide spuit. Het is van cruciaal belang dat het apparaat niet overdreven worden aangescherpt. Over-het aandraaien van de verzamelde menginrichting in dit stadium zal schade aan de kappen en veroorzaken lekken. Onder-aanscherping zal ook leiden tot lekken.
Deel 4: Het mengen van proteïne-oplossing en Lipid: Het maken van de mesofase
- Van kracht te mengen, vooraf de zuiger op het eiwit kant van de verzamelde mengeenheid tot het uiterste, met de duim of wijsvinger het besturen van de eiwit-oplossing uit het eiwit spuit, door middel van de koppeling en in de lipide spuit.
- De zuiger aan de lipide kant wordt nu gebruikt om terug te rijden de inhoud van de lipide spuit door de koppeling en in het eiwit spuit.
- Het proces wordt vele malen herhaald, af en toe, een honderd passages of meer nodig om een homogene mesofase te produceren. Aan het begin van het mengen, vervoer van materiaal en weer via de koppeling kan worden onregelmatig en soms is extra kracht nodig is om effect te mengen. Initial mengen gaat meestal gepaard met de ontwikkeling van een niet-uniforme vertroebeling in het monster. Als homogenisering vordert, de textuur wordt meer uniforme en karakteristiek van de viskeuze kubieke fase, net als het uiterlijk van de opkomende kubieke mesofase.
- Als de omstandigheden geschikt zijn en de kubieke fase vormt, moet de dispersie optisch transparant worden weergegeven in het reservoir zit. Daarom moet de markeringen op de spuit duidelijk leesbaar zijn door de mesofase in het vat.
- Zeer lichte afkoeling van het monster tijdens het mengen door het plaatsen van de spuit mixer voor een korte tijd op het ijs kunnen versnellen homogenisering en de verwezenlijking van de doorzichtigheid. Het is echter belangrijk om niet te Overkoel het monster.
- Zorg moeten worden genomen om te voorkomen dat extreem krachtig mengen, omdat dit kan leiden tot monster temperatuur te laten oplopen als gevolg van wrijving verwarming 3.
Deel 5: Het laden van de dispenser
- Verwijder de naald en de zuiger van een 10-pi Hamilton spuit. Laat de Teflon ferrule op zijn plaats.
- Verwijder de borgmoer van de dispenser met behulp van een klein muntje.
- Met de ratel arm volledig teruggetrokken, plaatst u de spuit - zonder zuiger en de naald - door het houden ring van de dispenser.
- Vervang de borgmoer, pakking zijde naar de spuit, en schroef het in goed op het open uiteinde van de spuit.
Zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen de spuit goed gecentreerd op het bedrijf ring en dat het vat is parallel aan de ratel arm. Beide kunnen worden beoordeeld door het oog. Deze twee eisen zijn van cruciaal belang om lekkage te voorkomen. - Passeren van de zuiger door de aangrijpende ring met de grijper moer losgeschroefd een paar slagen en begeleiden de zuiger in het open uiteinde van de spuit. Trap het ratel arm. Verplaats de zuiger in de cilinder en controleer of het reizen vrij en waar in het vat. Het kan helpen om de schroef los van het zaagblad aan de zuiger vrij bewegen te vergemakkelijken. Zorg ervoor dat het doet. Druk de zuiger totdat de Teflon tip lijn ligt met de nul-il streep op het vat. Als de schroef van het zaagblad was los, draai het en controleer dat de zuiger vrij kan bewegen.
- Verplaats de zuiger aan de ene kant van de verzamelde mengeenheid om de nul ui deelstreep aan de mesofase naar de andere spuit en de koppeling.
- Koppel de lege spuit (met de huls op zijn plaats) van de meng-unit en sluit onmiddellijk de geladen spuit - met de koppeling eenttached - de schroefdraad beëindiging van de 10-pi doseren spuit. De mate van dichtheid waarmee koppeling wordt gedaan is van cruciaal belang, zoals reeds vermeld.
- Laad de verstrekking spuit door het indrukken van de zuiger van de 100-il spuit, zodat de mesofase transfers via de koppeling.
- Veilige een korte, platte punt naald om de stalen beëindiging van de verstrekking spuit en draai voorzichtig op zijn plaats.
- Klem de zuiger naar de ratel arm door het aandraaien van de moer in de pakkende ring. Zorg ervoor dat u niet over-draai de moer, want dit kan scoren en vervormen van de zuiger waardoor deze onbruikbaar wordt. Het is belangrijk dat het traject aan de ratel arm in de geklemde toestand worden beperkt tot niet meer dan een centimeter, zoals blijkt in de video. Afgezien van deze, zal de zuiger de neiging hebben om gesp en levering kan falen.
- Druk op de ratel trommel een paar keer aan de zuiger vooruitgang in het vat, waardoor het vullen van het dode volume van de naald en het laden van de naald. Deze stap moet worden herhaald (tot tien keer) tot een continue reeks van de mesofase blijkt uit de punt van de naald.
- Kristallisatie onderzoeken dient onmiddellijk te beginnen, omdat sommige eiwitten zijn instabiel in de kubieke fase zonder toegevoegde neerslagmiddel.
Deel 6: Het opzetten van Kristallisatie Platen
- Plaats een multi-well plaat en kristallisatie dekglaasje op een oppervlak een paar centimeter boven de werkbank verhoogd voor het gemak van het laden. Een optimaal contrast en verbeterde zichtbaarheid worden bereikt wanneer het oppervlak is iets donkerder.
- Homogeniseer de neerslag oplossingen en verkondigen van de flacons. Stel de neerslag dispenser pipet om een ui.
- Met de verstrekking spuit verticaal gehouden in de ene hand, gebruik dan de vrije hand om de punt van de naald in het centrum en direct boven de basis van goed nummer 1 positie. Druk op de knop op de herhalende dispenser om een bolus van mesofase verdrijven op het glas oppervlak. De bolus volume is 200 nL wanneer de standaard te herhalen dispenser wordt gebruikt met een 10-pi spuit. De tip van de naald mag niet meer dan een paar honderd micrometer boven de basis van het goed om een goede levering te garanderen.
- Na vier aangrenzende putten worden geladen met mesofase, plaats een ul neerslagmiddelen oplossing op de top van elke mesofase bolus met behulp van een 2-il pipet en standaard wegwerp tips.
- Zo snel mogelijk, vierkant plaats een dekglaasje over de gevulde putten gelijkmatig dek ze af. Voor het uitvoeren van een waterdichte afdichting, gebruik een spatel om druk uit te oefenen op de dekglaasje waar hij contact maakt met de blootgestelde plakkerige oppervlak van de spacer tape.
- De mesofase en neerslagmiddelen dosering proces kan worden herhaald totdat alle putjes op de plaat worden geladen en verzegeld.
- Duidelijk label de plaat voor het bijhouden doeleinden. Lichtgevoelige eiwitten worden meestal behandeld door de platen wikkelen in aluminiumfolie alvorens ze in de incubatiekamer.
- Leg de platen in een temperatuur-gecontroleerde ruimte, meestal bij 20 ° C.
- Op een regelmatig schema, inspecteer de putten voor kristalgroei het gebruik van een gepolariseerd licht microscoop met een 10 of 20-voudige doelstelling. Het schema wordt gebruikt in het labo van de auteur is als volgt: dag 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 en 60 post-setup. Inspecteer zorgvuldig de mesofase bolus het aanpassen van de diepte van de focus binnen de 0,14 mm dikke monster. Onderzoek moet worden gedaan, zowel in normaal licht en tussen de gekruiste polarisatoren-.
Deel 7: representatieve resultaten
Het uiterlijk van de resulterende kristallen zal variëren met de inherente kleur van het membraan eiwit, de polarisatie van het licht gebruikt voor inspectie van (of het gebrek daarvan) en de methode en de kwaliteit van de verlichting. Figuur 6 toont een aantal mogelijke kristal optredens. Natuurlijk gekleurde membraaneiwitten groeien in meso wanneer bekeken met normaal licht kunnen lijken op die in figuur 6 (Panels b en d). Kleurloze membraaneiwit kristallen groeien in de kubieke fase waarin bekeken met een normale licht kunnen lijken op die in figuur 6 (Panel e). Ten slotte kunnen kleurloze membraaneiwit kristallen groeien in meso wanneer bekeken met gepolariseerd licht zien als in figuur 6 (Panels a en c).
De volgende stappen in het totale proces van structuur vastbesloten zijn om te oogsten en cryo-cool de kristallen en op te nemen en X-ray diffractie analyseren van hen. Deze onderwerpen worden behandeld in afzonderlijke Jupiter artikelen.
Figuur 1. Schematische voorstelling van een biologisch membraan met de lipide dubbellaag in en op die gelegen zijn een verscheidenheid van eiwitten.
Figuur 2. De structuurvan de vitamine B-12 transport van eiwitten, BtuB, opgelost met behulp van MX en kristallen gegroeid door de in meso methode 6 geïllustreerd in dit artikel Jupiter.
Figuur 3. De structuur-functie cyclus illustreert veel van de stappen die betrokken zijn bij het verkrijgen en het gebruik volledige structurele informatie over een eiwit.
Figuur 4. Het stroomschema samenvatting van de stappen betrokken bij de productie van membraan eiwitkristallen door de in meso methode. Alleen die stappen, omgeven door de gestippelde rode lijn komen aan bod in dit artikel Jupiter. Van Reference 2.
Figuur 5. Een vereenvoudigde temperatuur-samenstelling fase diagram voor de lipide (monoolein) / water-systeem. Kristallisatie onderzoeken zijn ingesteld op 20 ° C, waar de lipide verzadigd raakt met water op 40% hydratatie. De gedetailleerde fasediagram is verkrijgbaar in Reference 5.
Figuur 6. Kristallen van membraaneiwitten groeien in de lipidische mesofase.
(A) vitamine B-12 transport van eiwitten, BtuB 6, (b) light-harvesting complex II 7, (c) de adhesine / invasin OPCA 8, (d) bacteriorhodopsin 9, (e) een koolhydraat transporter van Pseudomonas. Beelden die met normaal licht (b, d, e) en tussen gekruiste polarisatoren (a, c).
Discussion
De kubieke fase is een delicate en dynamische omgeving die drastisch kan veranderen met de wijziging van een aantal variabelen. Het is niet mogelijk om een beschrijving van de opzet van in meso-kristallisatie onderzoeken in de handmatige modus die alle potentiële valkuilen beschrijft. Echter, veel problemen worden voorkomen door het beoefenen van de techniek alvorens het naar dure eiwit-oplossingen en door het gebruik matiging druk uitgeoefend op spuiten tijdens het mixen. Correct gedaan, de in meso-methode kan kristallen van een breed scala aan eiwitten opleveren, is het aantal waaraan steeds meer.
De hier gegeven beschrijving van de opzet van in meso-kristallisatie onderzoeken is gericht op de handmatige modus. Het proces kan worden, en vaak wordt aangepast om automatisch instellen van de kristallisatie platen te vergemakkelijken in die gevallen dat grootschalige screening van kristallisatie omstandigheden vereisen.
Acknowledgments
Er zijn velen die hebben bijgedragen aan dit werk en de meeste zijn afkomstig uit de Caffrey Membrane structurele en functionele Biology Group, zowel in het verleden en de huidige leden. Om alle breiden wij onze hartelijke dank en waardering. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), de National Institutes of Health (GM75915), en de Universiteit van Limerick.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein solution | Reagent | Various | Various | |
| Lipid (monoolein) | Reagent | Sigma-Aldrich | Various | |
| Precipitant solutions | Reagent | Various | Various | |
| Purified water | Reagent | EMD Millipore | ||
| Pipetting devices | Tool | Pipetman | Various | |
| Disposable pipet tips | Disposable | Pipetman | Various | |
| Gas-tight syringes | Tool | Hamilton Co | 80265 (25-µl) | |
| Syringe tips | Tool | Hamilton Co | 7770-020 (gauge 22) | |
| Narrow bore coupler* | Tool | Hamilton Co | various/EBS-LCP-2 | |
| Repeating dispenser | Tool | Hamilton Co | 83700 | |
| Silanized glass microscope slides | Disposable | Gold Seal | 3010 | |
| microscope coverslips | Disposable | Fisher Scientific | 12-548C | |
| Perforated double-stick spacer tape | Disposable | Saunders Corporation (hole-punched) | NA | |
| Tweezers | Tool | Various | NA | |
| Brayer (roller) | Tool | Fisher Scientific | 50820937 | |
| Chipped ice | Temperature Control | N/A | NA | |
| Tissues | Disposable | N/A | NA | |
| Calculator | Tool | Various | NA | |
| Lab notebook | Tool | Various | NA | |
* Full details for machining your own Narrow Bore Coupler are provided in Reference 3. |
||||
References
- Caffrey, M. Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases. Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases. Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
- Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21, 223-234 (2000).
- Cherezov, V. In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution. J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).
- Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases. J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).
- Cherezov, V. In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin. Proteins. 71, 24-34 (2008).
- Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).
