Summary
Ici est décrit la procédure de mise en œuvre dans le Groupe Membrane Biology Caffrey structurale et fonctionnelle de mettre en place manuellement des essais de cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidique.
Abstract
Un protocole détaillé pour la cristallisation des protéines membranaires en utilisant mésophases lipidique est décrite. Cette méthode a été diversement appelée la phase lipidique cubique ou dans la méthode de méso. La méthode a été montré pour être très polyvalent en ce sens qu'elle a été utilisée pour résoudre rayons X des structures cristallographiques des protéines procaryotes et eucaryotes, les protéines qui sont monomériques, homo-et hétéro-multimériques, chromophore contenant et le chromophore-libre, et l'alpha hélice et le bêta-tonneau protéines. Les récents succès en utilisant la cristallisation méso sont les humains conçus bêta2-adrénergiques et adénosine A2A G récepteurs couplés aux protéines. Les protocoles sont présentés pour la reconstitution de la protéine membranaire dans la mésophase monooléine basée, et pour la mise en place des cristallisations dans le mode manuel. Des étapes supplémentaires dans le processus global, comme la récolte de cristal, doivent être abordés dans les articles vidéos avenir. Le temps nécessaire pour préparer la mésophase protéines chargées et de mettre en place une plaque de cristallisation est manuellement environ une heure.
Protocol
Un objectif important dans le domaine de la biologie structurale et fonctionnelle est la membrane biologique (Figure 1). La membrane qui entoure la cellule et sub-cellulaire des organites lorsqu'il est présent, est une structure moléculaire fine seulement deux molécules lipidiques à travers et est parsemée de protéines. Structure et fonction appliquée à la fois des lipides et des protéines d'intérêt. Cependant, l'accent de cet article est réservé aux protéines membranaires.
Une meilleure compréhension de la façon dont les protéines membranaires de fonction au niveau moléculaire est recherché pour deux raisons. Premièrement, il ya la satisfaction intellectuelle de savoir comment ils fonctionnent. Deuxièmement, en sachant comment une protéine fonctionne, il ya toujours la perspective d'être en mesure de fixer elle devrait le dysfonctionnement ou d'améliorer, voire de le modifier pour des applications particulières. Conception de médicaments est un résultat évident de ce type de travail. Une approche pour trouver comment une protéine membranaire fonctionne au niveau moléculaire est de déterminer sa structure. Cela implique l'établissement de l'emplacement dans l'espace en 3 dimensions de tous les atomes, ou au moins tous les atomes non hydrogène, qui composent la protéine. La méthode que nous utilisons à cette fin est macromoléculaires cristallographie aux rayons X (MX). La figure 2 montre un exemple d'une protéine membranaire dont la structure a été déterminée en utilisant MX. Un cristal de qualité de diffraction de la protéine est nécessaire de faire MX.
Clairement, il ya de nombreuses étapes impliquées dans la détermination des structures par cristallographie macromoléculaire. Ceci est illustré dans la figure 3. Typiquement, il s'agit notamment d'identifier une cible protéine membranaire, puis la production, la purification et la cristallisation. Des mesures de diffraction sont effectuées sur le cristal à l'aide d'une maison ou d'un synchrotron source de rayons X. Les données de diffraction sont traitées donnant une carte de densité d'électrons qui est ensuite équipé d'un modèle moléculaire. Le modèle, une fois raffiné, peuvent être utilisés pour explorer le mécanisme d'action de la protéine et de la structure basée sur la conception de médicaments.
L'objet de cet article est de montrer comment nous produisons de la qualité des cristaux par diffraction des protéines membranaires en utilisant mésophases lipidiques, par le soi-disant méthode de méso. Un examen récent de la méthode et son champ de référence est disponible en 1 (Caffrey, 2009). Le protocole étape par étape, nous allons suivre ici est décrite dans la référence 2 (Caffrey et Cherezov, 2009).
Un organigramme récapitulant les étapes impliquées dans et le temps requis pour la mise en place d'une protéine de la membrane méso essai cristallisation est montré dans la figure 4. Cet article couvre les étapes ci-joint par des lignes en pointillés rouges.
Partie 1: Préparation des plaques de cristallisation
- Position une lame de microscope silanisées sur le banc de travail.
- Retirez le couvercle de protection en papier d'une surface d'une bande de ruban adhésif perforé entretoise double (disponible dans le commerce, voir le tableau des réactifs et équipements spécifiques ci-dessous).
- Placez le ruban adhésif, côté collant vers le bas, en contact avec la surface de la lame.
- Pression-joint la bande à la diapositive en utilisant un Brayer ou au rouleau. Le papier d'aluminium peut être placé entre le ruban et le rouleau à protéger la base du puits.
- Retirez le couvercle du deuxième document de la bande pour exposer sa surface supérieure collante.
- Placez des lamelles individuelles silanisé à proximité de la plaque d'étanchéité rapide et efficace des puits dès que le chargement est terminé.
Partie 2: Préparation de la seringue lipides
- Placez le lipide (souvent monooléine) dans un bloc à température contrôlée à 45 ° C pendant 3 minutes pour le rendre liquide.
- Alors que la fonte des lipides est de préparer deux 100-uL étanche seringues Hamilton pour une utilisation dans l'étape de mélange entre protéines et lipides. Retirez l'embout en téflon de la seringue qui va contenir la solution de protéines. Placez la seringue qui tiendra le lipide à côté de lui (en laissant sa férule en place).
- Branchez le coupleur (voir tableau des réactifs et équipements spécifiques ci-dessous et de référence 3 (Cheng et al., 1998)) à la seringue des lipides. Serrer le coupleur à la seringue, mais ne pas trop serrer. Retirer le piston du canon de la seringue de lipides.
- Notez que les lipides doivent être fondus avant de procéder. Régler la pipette à 30 uL et prendre lentement jusqu'à environ 30 uL de lipides fondus. Lentement offrir autant de lipides fondus comme vous pouvez dans l'extrémité ouverte de la seringue en prenant soin de ne pas introduire les lacunes de l'air.
- Placez le piston dans le cylindre en contact avec le lipide fondu et avancer lentement le piston du canon avec la seringue tenue verticalement comme l'a montré dans la vidéo. Les bulles d'air qui peuvent être piégés par inadvertance devrait augmenter dans le processus et être libéré.
- Soigneusement déterminer le volume de lipides dans la seringue par la lecture des marques sur le corps de la seringue.
- Faites glisser le ferrdule sur l'aiguille qui s'étend de l'attelage. Utilisez le piston pour forcer la fusion des lipides le baril et lentement et doucement dans l'aiguille à la base de l'attelage.
Partie 3: Préparation de la seringue de protéines
- La solution de protéine doit être filé à 14000 g pendant 5 à 10 minutes à 4 ° C pour éliminer les gros agrégats, avant la mise en place des essais de cristallisation. Retirer la solution de protéines de la glace et le laisser se stabiliser à la température ambiante.
- Calculer le volume de solution de protéine à utiliser pour former la phase cubique à ou près de l'hydratation complète. Pour monooléine à 20 ° C, l'hydratation avec de l'eau se produit à l'eau de près de 40% (en masse) comme dans le diagramme de phase 5 (figure 5).
- Avec un 25 ou 50 uL seringue Hamilton prendra le volume nécessaire de solution de protéine. Transfert de la solution sur le bout du piston en téflon dans le barillet de la seringue de protéines en prenant soin d'éviter les bulles d'air.
- Soigneusement retirer l'aiguille et mesurer le volume de solution de protéine dans la seringue. Il doit correspondre à la valeur apportée à l'étape précédente.
- Lentement pouces jusqu'à la solution de protéines du baril de finir au ras de son extrémité ouverte.
- Visser la seringue à la protéine dans l'extrémité ouverte de l'attelage fixée à la seringue des lipides. Il est essentiel que l'appareil ne soient pas trop serrés. Un serrage excessif du dispositif assemblé mélangeant à ce stade pourrait endommager les embouts et causer des fuites. Sous-serrage va aussi conduire à des fuites.
Solution de protéines et de lipides Mixage:: Partie 4 Faire la mésophase
- Pour effectuer le mélange, l'avance du piston sur le côté des protéines de l'unité de mélange assemblés à sa limite, avec le pouce ou l'index de conduite de la solution de protéines de la seringue en protéines, à travers le coupleur et des lipides dans la seringue.
- Le piston du côté des lipides est maintenant utilisé pour piloter le contenu de la seringue de lipides en arrière à travers le coupleur et les protéines dans la seringue.
- Le processus est répété plusieurs fois, parfois, une centaine de passages ou plus sont nécessaires pour produire une mésophase homogène. Au début du mélange, la circulation des matériels avant et en arrière à travers le coupleur peut être inégale et, parfois, une force supplémentaire est nécessaire pour effectuer le mélange. Le mélange initial est généralement accompagnée par le développement d'un trouble non uniforme dans l'échantillon. Comme homogénéisation progresse, la texture devient plus uniforme et caractéristique de la phase visqueuse cubes, tout comme l'aspect visuel de la mésophase émergents cubes.
- Si les conditions sont appropriées et les formes phase cubique, la dispersion devrait apparaître optiquement transparents dans la seringue. Ainsi, les inscriptions sur le corps de la seringue doit être clairement lisible à travers la mésophase dans le canon.
- Refroidissement très légère de l'échantillon durant le mélange en plaçant le mélangeur une seringue pour un court laps de temps sur la glace peut accélérer l'homogénéisation et la réalisation de la transparence. Cependant, il est important de ne pas trop la échantillon.
- Des précautions doivent être prises pour éviter le mélange extrêmement vigoureuse, car cela peut causer température de l'échantillon à augmenter en raison du chauffage par frottement 3.
Partie 5: Chargement du distributeur
- Retirez l'aiguille et le piston d'une seringue de 10 uL de Hamilton. Laisser l'embout téflon en place.
- Retirer l'écrou de retenue du distributeur à l'aide d'une petite pièce de monnaie.
- Avec le bras de cliquet entièrement retirée, insérez la seringue - sans son piston et l'aiguille - à travers l'anneau de maintien du distributeur.
- Remplacer l'écrou de retenue, côté joint face à la seringue, et vissez solidement sur l'extrémité ouverte de la seringue.
Des précautions doivent être prises pour assurer la seringue est correctement centré dans l'anneau de maintien et que le baril est aligné parallèlement au bras de cliquet. Les deux peuvent être jugés par les yeux. Ces deux exigences sont essentielles pour éviter les fuites. - Passe le piston à travers l'anneau de préhension avec l'écrou dévissé pince de quelques tours et guider le piston dans l'extrémité ouverte de la seringue. Appuyez sur le bras de cliquet pleinement. Déplacer le piston dans le cylindre et vérifier qu'il se déplace librement et vrai dans le canon. Elle peut aider à desserrer la vis sur la barre de guide pour faciliter le piston se déplaçant librement. Assurez-vous que c'est le cas. Enfoncer le piston jusqu'à son extrémité téflon s'aligne avec la graduation zéro uL sur le canon. Si la vis sur le guide a été assouplie, elle resserrer et revérifier que le piston se déplace librement.
- Déplacer le piston d'un côté de l'appareil assemblé de mixage à la graduation zéro uL de transférer la mésophase à l'autre seringue et le coupleur.
- Déconnecter la seringue vide (avec son embout en place) de l'unité de mélange et de se connecter immédiatement la seringue chargée - avec le coupleur unettached - à la résiliation filetée de la seringue de 10 uL de distribution. Le degré d'étanchéité avec laquelle couplage est fait est essentiel, comme déjà indiqué.
- Charger la seringue de distribution en appuyant sur le piston de la seringue de 100 uL de sorte que les transferts de mésophase à travers le coupleur.
- Sécuriser un court, à bout plat aiguille pour la terminaison d'acier de la seringue de distribution et serrer soigneusement en place.
- Fixer le piston pour le bras de cliquet en serrant l'écrou dans l'anneau de préhension. Il faut prendre soin de ne pas trop serrer l'écrou, car cela peut marquer et déformer le piston le rendre inutilisable. Il est important que la plage de déplacement fournies au bras de cliquet dans l'état serré se limiter à pas plus d'un pouce, comme l'a montré dans la vidéo. Au-delà de cela, le plongeur aura une tendance à flamber et la livraison peut échouer.
- Appuyez sur le tambour à cliquet à plusieurs reprises pour faire avancer le piston dans le cylindre, comblant ainsi le volume vide de l'aiguille et le chargement de l'aiguille. Cette étape doit être répétée (jusqu'à dix fois), jusqu'à une chaîne continue de la mésophase émerge de la pointe de l'aiguille.
- Essais de cristallisation doit commencer immédiatement, comme certaines protéines sont instables dans la phase cubique, sans facteur déclenchant ajouté.
Partie 6: Mise en place plaques de cristallisation
- Placer une plaque de cristallisation de plusieurs puits et la lamelle sur une surface surélevée de quelques centimètres au-dessus du banc de travail pour faciliter le chargement. Un contraste optimal et une meilleure visibilité sont obtenus lorsque la surface est légèrement sombre.
- Homogénéiser les solutions précipitant et déboucher le flacon. Régler la pipette précipitants de distribution à 1 pi.
- Avec la seringue de distribution maintenu verticalement dans une main, utilisez la main libre à la position de la pointe de l'aiguille dans le centre et directement au-dessus de la base de plusieurs puits 1. Appuyez sur le bouton sur le distributeur de répéter à expulser un bolus de mésophase sur la surface du verre. Le volume de bolus est de 200 nL lorsque le distributeur standard de répétition est utilisé avec une seringue de 10 mL. La pointe de l'aiguille doit être pas plus de quelques centaines de micromètres au-dessus de la base du puits pour assurer la livraison.
- Après 4 puits adjacents sont chargés avec mésophase, placer 1 ml de solution précipitant sur le dessus de chaque bolus mésophase aide d'une pipette de 2 uL et standard des embouts jetables.
- Aussi rapidement que possible, placer une lamelle carrément sur les puits remplis de les couvrir uniformément. Pour réaliser un joint étanche à l'eau, utiliser une spatule pour appliquer une pression sur la lamelle où il prend contact avec la surface exposée de la bande collante entretoise.
- La mésophase et précipitant processus de distribution peut être répété jusqu'à ce que tous les puits sur la plaque sont chargés et scellés.
- Étiquette de la plaque clairement à des fins de suivi. Sensibles à la lumière des protéines sont généralement traitées en enveloppant les plaques dans du papier aluminium avant de les placer dans la chambre d'incubation.
- Placer les plaques dans une chambre à température contrôlée, habituellement à 20 ° C.
- Sur un horaire régulier, inspecter les puits pour la croissance cristalline en utilisant un microscope à lumière polarisée avec un objectif de 10 ou 20 fois. Le calendrier utilisé dans le laboratoire de l'auteur est comme suit: jour 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 et 60 post-installation. Inspectez soigneusement le bol mésophase ajuster la profondeur de champ dans l'échantillon 0,14 mm d'épaisseur. L'examen doit être fait à la fois à la lumière normale, et entre-croisés des polariseurs.
Partie 7: Résultats Représentant
L'apparition des cristaux résultants varient avec la couleur intrinsèque de la protéine membranaire, la polarisation de la lumière utilisée pour l'inspection (ou son absence) et la méthode et la qualité de l'éclairage. La figure 6 montre plusieurs apparitions à cristaux possible. Protéines de la membrane colorée naturellement de plus en plus méso lorsqu'on la visionne à la lumière normale peuvent ressembler à ceux de la figure 6 (Panneaux B et D). Cristaux incolores protéine membranaire croissante dans la phase cubique lorsqu'on la visionne à la lumière normale peut ressembler à ceux présentés dans la figure 6 (Groupe E). Enfin, cristaux incolores protéine membranaire de plus en plus méso vus en lumière polarisée peut ressembler à la Figure 6 (panneaux A et C).
Les prochaines étapes dans le processus global de détermination de la structure sont à récolter et à la cryo-refroidir les cristaux et d'enregistrer et d'analyser diffraction des rayons X de leur part. Ces sujets doivent être traités dans les articles JoVE séparé.
Figure 1. Représentation schématique d'une membrane biologique montrant la bicouche lipidique dans et sur lequel sont situés une variété de protéines.
Figure 2. La structurede la vitamine B 12 protéines, BtuB transport, résolu en utilisant MX et cristaux produits par la méthode de méso 6 illustré dans cet article Jupiter.
Figure 3. Le cycle de structure-fonction illustre plusieurs des étapes impliquées dans l'obtention et l'utilisation de l'information structurale complète au sujet d'une protéine.
Figure 4. L'organigramme résume les étapes impliquées dans la production de cristaux de protéine de la membrane par la méthode de méso. Seuls les étapes, entourée par la ligne pointillée rouge sont abordés dans cet article Jupiter. De la référence 2.
Figure 5. Un diagramme de phase température simplifiée composition pour le lipide (monooléine) / système d'eau. Essais de cristallisation sont mis en place à 20 ° C où le lipide sature avec de l'eau à hydratation de 40%. Le diagramme de phase détaillée est disponible dans la référence 5.
Figure 6. Cristaux de protéines membranaires croissante dans la mésophase lipidique.
(A) la vitamine B 12 des protéines de transport, BtuB 6, (b) collecteurs de lumière complexe II 7, (c) l'OPCA adhésine / invasine 8, (d) 9 bactériorhodopsine, (e) un transporteur de glucides à partir de Pseudomonas. Les images enregistrées avec la lumière normale (b, d, e) et entre polariseurs croisés (A, C).
Discussion
La phase cubique est un environnement délicat et dynamique qui peut changer radicalement avec l'altération d'un certain nombre de variables. Il n'est pas possible de donner une description de la configuration des essais de cristallisation dans le méso dans le mode manuel qui décrit tous les pièges potentiels. Cependant, de nombreuses difficultés peuvent être évitées par la pratique de la technique avant de l'appliquer à des solutions coûteuses et de protéines en utilisant la modération de la pression appliquée à des seringues durant le mélange. Fait correctement, la méthode de méso peut produire des cristaux d'une grande variété de protéines, dont le nombre est en constante augmentation.
La description donnée ici de la configuration des essais de cristallisation dans le méso est axé sur le mode manuel. Le processus peut être et est souvent modifié pour faciliter la configuration automatisée des plaques de cristallisation dans les cas qui requièrent dépistage à grande échelle des conditions de cristallisation.
Acknowledgments
Nombreux sont ceux qui ont contribué à ce travail et la plupart sont de la membrane Caffrey structurels et du groupe de biologie fonctionnelle, les deux membres passés et présents. Pour tout ce que nous adressons nos plus vifs remerciements et son appréciation. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de la Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), les National Institutes of Health (GM75915) et l'Université de Limerick.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein solution | Reagent | Various | Various | |
| Lipid (monoolein) | Reagent | Sigma-Aldrich | Various | |
| Precipitant solutions | Reagent | Various | Various | |
| Purified water | Reagent | EMD Millipore | ||
| Pipetting devices | Tool | Pipetman | Various | |
| Disposable pipet tips | Disposable | Pipetman | Various | |
| Gas-tight syringes | Tool | Hamilton Co | 80265 (25-µl) | |
| Syringe tips | Tool | Hamilton Co | 7770-020 (gauge 22) | |
| Narrow bore coupler* | Tool | Hamilton Co | various/EBS-LCP-2 | |
| Repeating dispenser | Tool | Hamilton Co | 83700 | |
| Silanized glass microscope slides | Disposable | Gold Seal | 3010 | |
| microscope coverslips | Disposable | Fisher Scientific | 12-548C | |
| Perforated double-stick spacer tape | Disposable | Saunders Corporation (hole-punched) | NA | |
| Tweezers | Tool | Various | NA | |
| Brayer (roller) | Tool | Fisher Scientific | 50820937 | |
| Chipped ice | Temperature Control | N/A | NA | |
| Tissues | Disposable | N/A | NA | |
| Calculator | Tool | Various | NA | |
| Lab notebook | Tool | Various | NA | |
* Full details for machining your own Narrow Bore Coupler are provided in Reference 3. |
||||
References
- Caffrey, M. Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases. Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases. Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
- Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21, 223-234 (2000).
- Cherezov, V. In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution. J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).
- Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases. J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).
- Cherezov, V. In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin. Proteins. 71, 24-34 (2008).
- Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).
