Summary
Neste vídeo, demonstramos o procedimento de ativação CD40-e expansão de células B murino de esplenócitos de camundongos C57BL / 6, que pode ser usado como um modelo de células apresentadoras de antígenos (APC) para estudar a indução de imunidade.
Abstract
A investigação sobre células B CD40 mostrou que melhora a sua capacidade de ativação apresentação de antígenos. Quando estimuladas com interleucina-4 e CD40 ligante (CD40L), células B humano pode ser expandido sem dificuldades a partir de pequenas quantidades de sangue periférico dentro de 14 dias para grandes quantidades de altamente pura CD40 células-B (> 10
Protocol
O protocolo para a geração de células CD40 de murino ativado B (mCD40B) de esplenócitos é dividido em duas partes: Parte A demonstra a preparação do ligante CD40 de murino (CD40L) expressando células HeLa (tmuCD40L HeLa), que será utilizado como placa obrigado células alimentadoras. Parte B descreve a real cultura CD40-B murinos.
A. Preparação de células alimentadoras (tmuCD40L HeLa)
O HeLa tmuCD40L é uma linha de células epiteliais humanas aderente, que nunca deve tornar-se completamente confluentes. As células são, portanto, dividido por duas vezes por semana. Cultura há mais de seis semanas não é recomendado.
- Remova o meio de idade a partir da cultura primária com uma pipeta estéril e lavar as células com 10 mL de PBS 1x. Aspirar o PBS após a lavagem.
- Adicionar 4 mL de 1x Tripsina / EDTA em um frasco de 75 cm 2 por 10-15 minutos a 37 ° C. Use tocando suave para retirar as células.
- Adicionar 10 mL de meio de tipo selvagem e giratória suavemente para parar a digestão com tripsina.
- Transferir a suspensão de células em um tubo de 50 mL com uma pipeta estéril e girar a células para baixo a 265 xg por 7 minutos.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 10 mL de meio de tipo selvagem. Conte o número de células de uma alíquota da suspensão de células e preparar três tubos de 50 mL com o número adequado de células:
- 2,5 x 10 6 células para subcultura
- 0,4 x 10 6 células / poço de irradiação utilizadas para a cultura de células murinas CD40-B
- restante para congelar (se necessário).
- Spin the células para baixo a 265 xg por 7 minutos.
- Remover o sobrenadante.
- Para subcultura: ressuspender 2,5 x 10 6 células em 10 mL de médio seleção em um frasco de 75 centímetros de cultura de células 2 (densidade celular de 2,5 x 10 5 células / mL) e incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2. Dividir as células duas vezes por semana.
- Para a cultura de células murinas CD40-B: Você precisa de 2,4 x 10 6 células para uma placa de 6 poços. Ressuspender as células HeLa em meio tmuCD40L tipo selvagem, a uma densidade de 0,2 x 10 6 células / mL e irradiar-los em 78 Gy. Placa de 2 mL da suspensão de células em cada poço e incube-os a 37 ° C com 5% de CO 2. Utilize este placas preparado para a estimulação de células B, quando as células HeLa são tmuCD40L aderente (pelo menos 4 horas: verificar a aderência do uso do microscópio, não espere mais de 24 h para iniciar a estimulação de células B). (Continue com B.)
B. murino CD40-cultura de células B
I. Elaboração de esplenócitos para CD40-estimulação (dia 0):
Por favor note: antes de continuar determinar que as células de alimentação são aderentes. Sempre adicionar novas soluções de murino imediatamente interleucina-4, β-mercaptoetanol e ciclosporina A para o meio de crescimento antes do uso.
- Dissecar baço de camundongos C57BL / 6 (haplótipo H-2b) e lavá-la duas vezes em 10-20 mL DMEM suplementado com Gentamicina [15μg/mL], transferindo-o com uma ponta de pipeta 10 ml de um tubo para outro. Evitar a transferência de contaminantes (por exemplo, o cabelo) do mouse. Mince baço por passagem através de um filtro de células (100μm) e enxaguar com outra peneira de 10 mL de meio. Spin down esplenócitos a 265 xg por 7 min em temperatura ambiente, ressuspender-los em 7ml muCD40-B médio de células, e os linfócitos separado por centrifugação Ficoll densidade. Para fazê-lo células da camada em 5 mL Mouse-Pancoll (pré-aquecido em temperatura ambiente) em um tubo de 15 ml e centrifugar a 450 xg por 30 min sem freio à temperatura ambiente.
- Empate fora de a maioria da camada superior, deixando intacta a camada de linfócitos na interface. Transferência de camada de linfócitos a um tubo de 50 mL frescos, lave uma vez com 30mL DMEM com Gentamicina [15μg/mL] para baixo, girando a 265 xg por 7 min para remover outras células. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de mCD40-B médio de lavar roupa. Determinar o número de células em uma alíquota da suspensão de células. Determine o número de células por contagem uma alíquota da suspensão de células.
- Spin para baixo a quantidade necessária de células em 265 xg por 7 minutos. Para uma placa de 6 poços 5 x 10 6 células / poço são necessários, portanto, 30 x 10 6 células por placa.
- Remover o sobrenadante e ressuspender os linfócitos em 1,25 x 10 6 células / mL em mCD40-B meio de cultura fresco suplementado com 1 U / mL de IL-4 como fator de crescimento, 100 mM β-mercaptoetanol e 0,63 mcg / mL A ciclosporina para prevenir conseqüência de células-T (concentrações indicados referem-se a um meio de cultura mL!).
- Retire o sobrenadante da placa de 6 poços de pré-incubados com células HeLa tmuCD40L.
- Delicadamente adicionar 4 mL da suspensão de linfócitos (1,25 x 10 6 células / mL) a cada poço da placa de 6 poços.
- Incubar a placa a 37 ° C com 5% de CO 2. No dia 3 reculture as células (Continue com II.1.).
II. Subcultura de células mCD40B (dia 3 e, em seguida, duas vezes por semana):
- Colheita aglomerado de células mCD40B por vigorosamente pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL e piscina-los em um tubo de 50 mL.
- Girar em 265 xg por 7 minutos e substituir completamente o sobrenadante com mCD40-B médio de lavar roupa. Contando a quantidade de células de uma alíquota, gire a células para baixo a 265 xg por 7 minutos. Ressuspender as células em mCD40B mCD40-B meio de cultura a uma concentração de 0,75 x 10 6 células / mL.
- Adicionar novas soluções de murino interleucina-4 em uma concentração de 1 U / mL, 100 Mercaptoethanol β-M e 0,63 mcg / mL ciclosporina A ao meio.
- Remover o sobrenadante de uma placa de 6 poços de pré-incubados com células irradiadas tmuCD40L HeLa.
- Delicadamente adicionar 4 mL da suspensão de células mCD40B (0,75 x 10 6 células / mL) a cada poço da placa de 6 poços.
- Incubar as placas a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Novamente subcultura as células a cada 3-4 dias para acabar com alta pureza murino células CD40-B ativadas após um total de 14 dias.
C. Resolução de problemas: O que se CD40-B células não crescem?
- Você tem verificado para CD40 ligante expressão de células de alimentação?
- São a placa-bound células alimentadoras usado para a estimulação com mais de 24 horas?
- Existe uma contaminação com micoplasma?
- Foi a solução interleucina-4 utilizada para a suplementação recém descongeladas e que teve a atividade biológico adequado?
- Foi β-mercaptoetanol e ciclosporina A adicionado na concentração correta?
Figura 1a.
Figura 1b.
Figura 1d.
Figura 2.
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Discussion
Modificações deste protocolo são possíveis, especialmente quanto à origem do estímulo-CD40 e do tipo de estirpe do rato utilizado, rendendo também na geração eficiente de células CD40 de murino B ativadas. Ahmadi et al. têm mostrado resultados semelhantes para fibroblastos de rato transfectadas com murino CD40 ligante. Nesta apresentação contexto de xeno-antígeno pode ser excluída com certeza, mas estudos intensivos em matéria de segurança e toxicidade in vivo não deu sinais de inflamação ou auto-imunidade reação neste cenário com células transfectadas HeLa. No entanto, a melhor alternativa representa um murino solúvel CD40 ligante com a ativação e proliferação de atividade, ao mesmo tempo, que é a nosso conhecimento não disponíveis comercialmente.
Este protocolo também funciona para linfócitos de ratos 129S2/SvPas (haplótipo H-2b), mas ainda não foi avaliada por linhagens de camundongos ainda mais até o momento. Além disso as diferenças de ajuste de densidade celular, a concentração de citocinas, a duração da ciclosporina A de tratamento, meios de cultura celular e pratos também podem levar a eficiente CD40-ativação de células B de camundongos com taxas de proliferação similar. No entanto, um intenso trabalho tem sido gasto na otimização deste sistema maximizando as taxas de ativação e proliferação, resultando no atual sistema.
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Disclosures
Os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes nacionais e europeus de manter laboratório animal. Referindo-se a lei alemã de bem-estar dos animais, os animais foram controlados regularmente pelas autoridades competentes.
Acknowledgments
Pedimos gentilmente agradecer ao Dr. Clemens Wendtner para fornecer tmuCD40-Ligand-linha celular HeLa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Preparation of Media: | |||
| 1. Feeder cell wild type medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 2. Feeder cell selection medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| Hygromycin B, 0.2 mg/mL | |||
| 3. mCD40-B washing medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 4. mCD40-B culture medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| MEM, 0.1mM (1x) | |||
| FBS, 10% | |||
| B. Miscellaneous Reagents: | |||
| RPMI 1640 | Invitrogen | REF 21875 | |
| D-MEM | Invitrogen | REF 41965 | |
| Dulbecco’s PBS (10x) | PAA Laboratories | Cat No H15-011 | |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 | |
| FBS | Lonza Inc. | Cat No DE14-802C | |
| HEPES Buffer | PAA Laboratories | Cat No S11-001 | |
| MEM NEAA | Invitrogen | REF 11140 | |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | Cat No P02-015 | |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 | |
| Cyclosporin A | Novartis AG | Cat No NDC 0078-0109-01 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen | REF 15400-054 | |
| C. Miscellaneous Supplies: | |||
| Sterile pipette tips | Sarstedt Ltd | ||
| 6-well plate | Nalge Nunc international | Cat No 140675 | |
| 50mL conical tube | BD Biosciences | Cat No 352070 | |
| Tissue culture flask | Sarstedt Ltd | Cat No 83.1813.002 | |
References
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