Summary
植物生物量是一个主要的碳中性的可再生资源，可用于生产生物燃料的使用。植物生物量主要由细胞壁，一个结构复杂的复合材料，被称为lignocellulosics。在这里，我们描述为一个全面的内容和组成的多酚类木质素分析协议。
Abstract
可再生，碳中性的，和可持续发展的原材料行业和社会的需要，已成为面向21世纪的最紧迫的问题之一。这再度引发了在植物产品作为工业原料使用液体燃料的运输生产的兴趣
Protocol
1。细胞墙隔离
- 大约60 - 70mg的空气或冷冻干燥植物材料研磨5.5毫米，在2毫升Sarstedt螺丝帽使用一个iWall管不锈钢球，研磨和配药机器人（30秒）。另一种非机械手的低吞吐量的程序，使用一个球，磨（retschmill）是在第二部分2。
- 1.5毫升的70％的水溶液乙醇添加到免除地面材料，旋涡彻底。
- 以10,000 rpm离心10分钟沉淀不溶于酒精残留。
- 吸或倒出上清液。
- 加入1.5毫升氯仿/甲醇（1:1 V / V）的解决方案去渣，彻底动摇管悬浮沉淀。
- 离心10,000 RPM为10分钟，并吸出或倒出上清液。
- 500μL丙酮中的悬浮颗粒。
- 蒸发与空气流在35 ° C，待干溶剂。
如果需要干燥的样品可存放在室温，直到进一步的处理。 - 要启动从样本中去除淀粉颗粒悬浮在一个0.1 M的醋酸钠缓冲液的pH值5.0分中评1.5毫升。
- 第20分钟Sarstedt管和热。在80 ° C在加热块。
- 清凉冰暂停。
- 添加以下代理颗粒：35微升0.01％叠氮化钠（NaN3的），35μL淀粉酶（50μg/ mL的H 2 O; 芽孢杆菌的物种，Sigma公司）; 17μL普鲁兰（17.8 acidopullulyticus芽孢杆菌;单位西格玛） 。第管和涡彻底。
- 悬挂在37℃摇床中的C孵育过夜。定向管水平助手改善混合。
- 热悬浮在100 ° C下10分钟，在加热块终止消化。
- 离心（10,000 RPM，10分钟），弃上清液含溶解淀粉。
- 洗净，加入1.5毫升的水，振荡，离心，洗涤水调迁，其余颗粒三次。
- 500μL丙酮中的悬浮颗粒。
- 蒸发与空气流在35 ° C，待干溶剂。这可能是必要的，也打破了管具有更好的干燥锅铲的材料。
干燥后的材料呈现孤立的细胞壁（lignocellulosics）。如果需要干燥的样品可存放在室温，直到进一步的处理。
2。木质素含量
这种方法是基于一个福岛和Hatfield 3方法。
- 称取1 - 1.5毫克的细胞壁物质准备（1）到2 ml容量瓶中留下一管空一个空白。
- 250丙酮液收集管底部的细胞壁物质冲洗管壁，丙酮蒸发下的气流非常温柔。
- 轻轻地沿管壁添加100μL新鲜的乙酰溴铵溶液（25％V / V冰醋酸中的乙酰溴），防止飞溅。
- 第容量瓶和热在50℃为2小时彗星
- 热与涡旋每15分钟增加一小时。
- 在冰上冷至室温。
- 新增400个2M的氢氧化钠和70μL新鲜配制的0.5 M的盐酸羟胺液。涡容量瓶。
- 完全填充容量瓶用冰醋酸，第2.0毫升标志和颠倒几次混合。
- 吸取200μL的解决方案的紫外线具体的96孔板，在酶标仪在280nm处读取。
- 乙酰溴溶解木质素（％ABSL）的比例，使用适当的系数（白杨= 18.21;草= 17.75;拟南芥= 15.69），用下面的公式确定：
ABSL％Calc工作：
10微克/毫克细胞壁单位乘法％ABSL
它可以帮助做至少有3盘读取的平均吸光度（ABS），因为微粒可导致吸光度值略有变化。注：0.539厘米的光程，但根据板，这可能需要确定。
3。木质素组成
这种方法是通过从罗宾逊和曼斯菲尔德5最近出版了一方法。
- 转移到一个螺丝thioacidolysis上限玻璃管约2毫克细胞壁物质（见1）。。
- 精心准备二乙基乙醚2.5％，三氟化硼（BF 3），10％的乙硫醇（EtSH）解决方案。您必须使用一个气球充满氮气，以取代二恶烷在用氮气瓶的丢失量。二恶烷是非常危险的，不拿样品或设备的引擎盖。需要为每个样品溶液的制备：175μL的二恶烷; 20μLEtSH; 5μL高炉3卷。
- 加入200μLEtSH，BF 3，每个样品中的二恶烷的解决方案。
- 样品瓶顶空与氮气和第立即清除。
- 热在100 ° C时轻轻搅拌每隔一小时4小时。
- 冰上冷却5分钟结束反应。
- 0.4M碳酸氢钠加入150μL，涡旋
- 对于清理中添加1毫升的水和0.5毫升乙酸乙酯，旋涡，让独立的阶段（顶部，底部水醋酸乙酯）。
- 转移到2毫升Sarstedt管150μL的醋酸乙酯层。确保没有水转。
- 溶剂蒸发与空气浓缩。
- 添加200μL丙酮和蒸发（共两次重复删除多余的水分）。
- 对于TMS衍生添加醋酸乙酯500μL，20μL吡啶，N，O -双（三甲基硅基）乙酰胺，以每管100μL。
- 孵育2小时25 ° C。
- 转移100μL成小瓶的GC / MS的反应，并添加100μL丙酮。
- 配备一个四极质谱仪或火焰离子化检测器的气相色谱法分析样品。安捷伦HP - 5MS柱的安装（X 0.25毫米X 0.25微米薄膜厚度30毫米）。以下的温度梯度是用溶剂延迟了30分钟和一个1.1毫升/分钟流速：初始保持在130 ° C，3分钟3℃/ min的坡道至250℃，保持1分钟;平衡到初始温度130 ° C
- 米/ 269米/ Z，Z，和239米/ Z，S，G和H单体，分别为（见图相对保留使用四烷内标（可选）倍或299频谱特征质量离子峰确定。 2）。木质素组件的组成是通过设置总峰面积的100％的量化
4。代表性的成果
墙上分析的一个例子是在图2。在这种情况下，杨树干（木）协议部分所述的各种程序进行了分析。木质素元件分离后thioacidolysis和TMS衍生的一个例子色谱图。显然，紫丁香的相对丰度（S），愈创木，（G）和P - hydroxyphenol - （H）的单位可确定。乙酰溴溶于木质素的内容是不言自明，可以壁干重的20-50％之间的预期值。应该注意的乙酰溴不溶解在墙上的木质素目前，增溶程度可以有所不同，视物。然而，这种方法是比较容易开展和快速的，并给出了在一个木质纤维材料的木质素含量的优秀近似值。
图1：木质纤维分析概述。细胞壁（lignocellulosics）原油干植物材料隔离。墙体材料，然后加权成等份，并细分为各种检测。墙体材料是乙酰溴和溶解的木质素由紫外线光谱量化处理。木质素成分的测定，墙体材料是受到thioacidolysis。溶酚醛树脂进行TMS衍生化和GC - MS分析，然后可以分离和量化。矩阵多糖的组成和结晶纤维素含量协议是讨论在第二部分 2 。
图2：杨树（ 胡杨tremoloides） 杨树木材的木质纤维综合分析木片所描述的协议。
Ligin组成，H P -羟基苯基，G愈创木，S紫丁香单位。
Discussion
描述的方法，使木质素含量和木质纤维植物的生物量组成的快速定量评估。使用iWall机器人约350个样本，每天可地面和免除。每人的各种分析方法的吞吐量不同。使用这里描述的协议，30个样本可以处理的木质素含量，并每天为木质素组成15。由于数据的最佳原料作物的定量性质，品种或基因型，可用于生产生物燃料的适用性评估。
Acknowledgments
我们非常感谢马修罗伯特韦瑟优质的技术服务和约翰拉尔夫，威斯康星大学的宝贵意见，讨论和杨木样本。这项工作的美国能源部（DOE）的大湖生物能源研究中心（美国能源部的BER科学DE - FC02 - 07ER64494办事处）和化学科学，地球科学和生物科学部，基础能源科学办公室，科学办公室资助美国能源部（无奖。DE - FG02 - 91ER20021）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydroxylamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 255580 | |
| Acetyl Bromide | Aldrich | 135968 | |
| Ethanethiol | Sigma-Aldrich | E3708 | |
| Borontrifluoride diethyl etherate | Fluka | 15719 | |
| N,O,-Bis(trimethylsilyl) acetimide | Fluka | 15241 | |
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 296309 | |
| Spectromax Plus 384 | Molecular Devices | Plus384 | |
| GC-MS | Agilent Technologies | 6890 GC/5975B MSD | (lignin composition) |
| 5.5mm Stainless Steel Balls | Salem Ball Company | (N/A) | |
| 96 well plate heat spreader | Biocision | Coolsink 96F | |
| Heating block | Techne | Dri-block DB-3D | |
| Sample concentrator | Techne | FSC400D |
References
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