Summary
Växtbiomassa är en stor koldioxidneutral förnyelsebar resurs som kan användas för produktion av biobränslen. Växtbiomassa består huvudsakligen av cellvägg, ett strukturellt komplexa kompositmaterial kallas lignocellulosa. Här beskriver vi ett protokoll för en omfattande analys av innehåll och sammansättning polyphenolic lignin.
Abstract
Behovet av förnybara, koldioxidneutrala, och hållbara råvaror för industrin och samhället har blivit en av de mest angelägna frågorna för 21-talet. Detta har återuppväckt intresset för användningen av växtskyddsmedel som industriell råvara för produktion av flytande bränslen för transporter
Protocol
1. Cellvägg Isolering
- Grind ungefär 60-70 mg av luft-eller frystorkat växtmaterial med 5,5 mm rostfritt stål kulor i en 2 ml Sarstedt skruvlock rör med hjälp av en iWall, en slipning och utlämning robot (30 s). Ett alternativ som inte robotliknande låg genomströmning förfarande med en kulkvarnar (retschmill) finns i del II 2.
- Tillsätt 1,5 ml av 70% vattenlösning etanol till den doserade malda materialet, och vortexa grundligt.
- Centrifugera vid 10000 rpm i 10 min till pellets alkohol olösliga rester.
- Aspirera eller dekantera supernatanten.
- Tillsätt 1,5 ml kloroform / metanol (1:1 v / v) lösning på rester och skaka röret noggrant för att suspendera pelleten.
- Centrifugera vid 10000 rpm i 10 minuter och aspirera eller dekantera supernatanten.
- Resuspendera pelleten i 500 l av aceton.
- Avdunsta lösningsmedlet med en ström av luft vid 35 ° C tills det är torrt.
Vid behov torkade proverna kan förvaras i rumstemperatur tills vidare bearbetning. - För att initiera avlägsnande av stärkelse från provet suspendera pelleten i 1,5 ml av en 0,1 M natriumacetat buffert pH 5,0.
- Cap de Sarstedt rör och värme i 20 min. vid 80 ° C i ett värmeblock.
- Kyl suspensionen på is.
- Lägg till följande agenter att pelleten: 35 ìl av 0,01% natriumazid (NaN3), 35 l amylas (50 mikrogram / ml H 2 O, från Bacillus arter, Sigma), 17 l pullulanase (17,8 enheter från Bacillus acidopullulyticus, Sigma) . Cap röret och vortexa grundligt.
- Suspensionen är inkuberas över natten vid 37 ° C i shakern. Orientera rören horisontellt medhjälpare bättre blandning.
- Värm suspensionen vid 100 ° C i 10 min i ett värmeblock att avsluta matsmältningen.
- Centrifug (10.000 rpm, 10 min) och kassera supernatanten som innehåller solubilized stärkelse.
- Tvätta den återstående pellets tre gånger genom att tillsätta 1,5 ml vatten, vortexa, centrifugering och dekantering av tvättvattnet.
- Resuspendera pelleten i 500 l av aceton.
- Avdunsta lösningsmedlet med en ström av luft vid 35 ° C tills det är torrt. Det kan bli nödvändigt att bryta upp materialet i röret med en spatel för bättre torkning.
Det torkade materialet presenterar isolerade cellväggen (lignocellulosa). Vid behov torkade proverna kan förvaras i rumstemperatur tills vidare bearbetning.
2. Lignin innehåll
Denna metod är baserad på en rapporterad metod Fukushima och Hatfield 3.
- Väg upp 1 - 1,5 mg av beredda cellvägg material (se 1) i 2 ml mätkolv lämnar en tub tom för en tomt.
- Skölj röret väggar med 250 l aceton för att samla in det material cellväggen på botten av röret, och indunsta aceton väldigt försiktig i luftflödet.
- Tillsätt försiktigt 100 ìl av nybakade acetyl bromid-lösning (25% v / v acetyl bromid i isättika) längs röret väggarna för att förhindra stänk.
- Cap mätkolv och värme vid 50 ° C under 2 timmar
- Värme för en extra timme med vortexa var 15 minut.
- Cool på is till rumstemperatur.
- Tillsätt 400 ìl 2M natriumhydroxid och 70 ìl av nyberedd 0,5 M hydroxylamin hydroklorid. Vortex-mätkolvar.
- Fyll mätkolv exakt 2,0 ml märket med isättika, mössa och vänd flera gånger för att blanda.
- Pipettera 200 l av lösningen till en UV-specifika 96 brunnar och läsa i ELISA-läsare vid 280 nm.
- Bestäm andel av acetyl bromid lösliga lignin (% ABSL) med en lämplig koefficient (poppel = 18,21, Gräs = 17,75; Arabidopsis = 15,69) med följande formel:
% ABSL Calc:
Multiplikation av% ABSL med 10 resultat i ug / mg cellväggen enhet
Det bidrar till att göra minst 3 tallriken läser till genomsnittlig absorbans (abs) eftersom partiklar kan orsaka en liten variation i absorbansvärden. Obs: 0,539 cm representerar sträckenhet, men beroende på tallriken denna kan behöva fastställas.
3. Lignin Sammansättning
Denna metod är adopterad från en nyligen metod publicerad av Robinson och Mansfield 5.
- Överför ca 2 mg cellvägg material (se 1.) Till en skruv tak glasrör för thioacidolysis.
- noggrant förbereda 2,5% bortrifluorid diethyl etherate (BF 3), 10% ethanethiol (EtSH) lösning. Du måste använda en ballong fylld med kvävgas för att tränga undan den förlorade volymen i dioxan flaskan med kväve. Dioxan är mycket farlig, inte tar prover eller utrustning ur huven. Volymerna som behövs för beredningen av lösningen per prov: 175 l dioxan, 20 l EtSH, 5 l BF 3.
- Tillsätt 200 ìl EtSH, 3 BF, dioxan lösning till varje prov.
- Töm flaskan headspace med kvävgas och locket omedelbart.
- Värme på 100 ° C i 4 timmar med varsam blandning varje timme.
- Avsluta reaktionen genom att kyla på is i 5 minuter.
- Tillsätt 150 ìl 0,4 natriumbikarbonat, virvel
- För saneringen tillsätt 1 ml vatten och 0,5 ml etylacetat, virvel och låt faserna separerar (etylacetat ovanpå, vatten på botten).
- Överför 150 ìl av etylacetat lagret i en 2 ml Sarstedt rör. Se till att inget vatten överförs.
- Avdunsta lösningsmedlet genom att en koncentrator med luft.
- Tillsätt 200 l aceton och avdunsta (upprepa för totalt två gånger avlägsna överflödigt vatten).
- För TMS derivatisering lägga 500 l etylacetat, 20 ìl pyridin, och 100 l N, O-bis (trimetyl) acetamid till varje rör.
- inkubera i 2 timmar vid 25 ° C.
- Överför 100 ìl av reaktionen i en GC / MS-flaskan och tillsätt 100 l aceton.
- Analysera proverna av GC utrustad med en quadrupol mass-spektrometer eller flamjoniseringsdetektor. En Agilent HP-5MS kolumnen är installerad (30 mm x 0,25 mm x 0,25 ìm filmtjocklek). Följande temperaturgradienten används med ett 30 min lösningsmedel dröjsmål och en 1,1 ml / min flöde: Inledande håll vid 130 ° C i 3 min, en 3 ° C / min ramp till en 250 ° C och håll i 1 min, låt jämvikt till den ursprungliga temperaturen på 130 ° C.
- Toppar identifieras av relativa retentionstider med tetracosane intern standard (tillval) eller genom karakteristiska masspektrum joner av 299 m / z, 269 m / z, och 239 m / z för S, G och H monomerer, (se figur. 2). Sammansättningen av lignin komponenterna kvantifieras genom att den totala toppytan till 100%
4. Representativa resultat
Ett exempel på en vägg analys presenteras i figur 2. I detta fall poppel stamceller (trä) analyserades av de olika förfaranden som beskrivs i protokollet avsnitt. Ett exempel kromatogrammet för separation av lignin-komponenterna efter thioacidolysis och TMS-derivatisering visas. Tydligt att den relativa förekomsten av syringyl-(S), guaiacyl-(G) och p-hydroxyphenol-(H) enheter kan fastställas. Innehållet i acetyl bromid lösliga lignin är självförklarande, kan man förvänta värden mellan 20-50% av väggen torrvikt. Man bör notera att acetyl bromid inte löses alla lignin som finns i väggen och att graden av lösningsgörande kan variera beroende på materialet. Dock är denna metod relativt lätt att utföra och snabb och ger en utmärkt approximation av lignin innehåll i en lignocellulosa material.
Figur 1:. Översikt av lignocellulosa analys cellväggar (lignocellulosa) är isolerade från råa torkade växtmaterial. Väggmaterialet är sedan vägs in i portioner och delas upp för olika analyser. Wall materialet är behandlat med acetyl bromid och solubilized lignin kvantifieras av UV-spektroskopi. För bestämning av lignin sammansättningen är väggmaterial utsätts för thioacidolysis. Den solubilized phenolics genomgå TMS derivatisering och kan sedan separeras och kvantifieras med GC-MS analys. Matrisen polysackarid sammansättning och kristallin cellulosa innehåll protokollet diskuteras i del II 2.
Figur 2:. Omfattande lignocellulosa analys av poppel trä träflis från poppel (Populus tremoloides) blev utsatt för beskrivs protokoll.
Ligin sammansättning, H p-hydroxifenyl, G guaiacyl, S syringyl enheter.
Discussion
De beskrivna metoderna möjliggör en snabb kvantitativ bedömning av ligninet innehåll och sammansättning av lignocellulosa växtbiomassa. Använda iWall roboten cirka 350 prover kan slipas och doseras per dag. Genomströmningen av olika analysmetoder per person varierar. Med hjälp av protokoll som beskrivs här, kan 30 prover behandlas för lignin innehåll, och 15 för lignin sammansättning per dag. På grund av den kvantitativa typ av uppgifter optimala grödor som råvara kan sort eller genotyper bedömas i termer av deras lämplighet för produktion av biobränsle.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för Matthew Robert Weatherhead för utmärkt teknisk service och John Ralph, University of Wisconsin för värdefulla råd, diskussioner och poppel trä provet. Detta arbete har finansierats av US Department of Energy (DOE) Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494) och av Chemical Sciences, geovetenskaper och biovetenskaper Division Office of Basic Energy Sciences, Office of Science , US Department of Energy (tilldelning nej. DE-FG02-91ER20021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydroxylamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 255580 | |
| Acetyl Bromide | Aldrich | 135968 | |
| Ethanethiol | Sigma-Aldrich | E3708 | |
| Borontrifluoride diethyl etherate | Fluka | 15719 | |
| N,O,-Bis(trimethylsilyl) acetimide | Fluka | 15241 | |
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 296309 | |
| Spectromax Plus 384 | Molecular Devices | Plus384 | |
| GC-MS | Agilent Technologies | 6890 GC/5975B MSD | (lignin composition) |
| 5.5mm Stainless Steel Balls | Salem Ball Company | (N/A) | |
| 96 well plate heat spreader | Biocision | Coolsink 96F | |
| Heating block | Techne | Dri-block DB-3D | |
| Sample concentrator | Techne | FSC400D |
References
- Carroll, A., Somerville, C. Cellulosic Biofuels. Annual Review of Plant Biology. 60, 165-165 (2009).
- Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part II: Carbohydrates. J Vis Exp. , (2010).
- Fukushima, R. S., Hatfield, R. D. Extraction and isolation of lignin for utilization as a standard to determine lignin concentration using the acetyl bromide spectrophotometric method. J. Agric. Food Chem. 49 (7), 3133-3133 (2001).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).
- Robinson, A. R., Mansfield, S. D. Rapid analysis of poplar lignin monomer composition by a streamlined thioacidolysis procedure and near-infrared reflectance-based prediction modeling. Plant J. 58 (4), 706-706 (2009).
- Somerville, C. Toward a systems approach to understanding plant-cell walls. Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).
- Teeri, T. T., Brumer, H. Discovery, characterization and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endo-transglycosylases. Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).
