Улучшенный метод выделения РНК из Лоблолли Пайн ( П. taeda L.) и других хвойных пород

Summary

Многие ткани растений, в том числе флоэмы и ксилемы от ладанной сосны (

Abstract

Ткани изолированы от хвойных пород, особенно тех, кто принадлежит к семейству сосновых, таких как ладанной сосны (

Protocol

Часть 1: Дерево Harvest

После дереве выбран и срубленные, важно работать аккуратно и как можно быстрее. Так как каждый другой тип ткани собирают, они должны располагаться непосредственно в свои жидкого азота суда, чтобы избежать перекрестного загрязнения образцов материала. Этот протокол РНК изоляции является масштабируемой.

1. Вырезать болты в длину около 0,5-0,75 м и с бензопилой оценка коры в двух или трех местах следующие продольной оси болта.
2. Использование древесины долото, работа края забил регионе до коры начинает отделяться от дерева и продолжать работать долотом, потянув назад на участке коры, пока он полностью отделяется от стебля.
3. Вторичные ксилемы собирают с прямым краем, односторонняя бритва путем соскабливания вдоль продольной оси болта, которая была очищенная от коры. Одежда латексные перчатки, чтобы минимизировать загрязнение ткани.
4. Флоэмы, который находится на внутренней стороне коры разделы, легко собирают ручной пилинг.
5. Реакция дерева собирают от нижней конечности после маркировки их с краской, чтобы указать их первоначальной ориентации относительно земли.
6. Конечности разрезают на болты 1-2 м и забил на противоположных сторонах вдоль продольной оси в соответствии с приблизительном местонахождении двух типов реакции дерева: напротив дерева (на верхней стороне конечностей) и сжатия древесины (на дне стороны конечностей). Кора отделяется от конечностей, как описано выше, за исключением того, что только кора покрытие каждого типа реакции дерева снимается за один раз. Вторичные ксилемы или флоэмы затем собирается, как описано выше и помещен в жидкий азот.
7. Другие образцы, такие как иглы, побегов и молодых шишек, могут быть собраны вручную или с помощью серпы по мере необходимости.
8. Сборник образцов замороженной в жидком азоте, должны быть помещены в отмеченные мешки или соответствующие контейнеры и упакован в сухой лед для отправки обратно в лабораторию.

Часть 2: Морозильник Милль обработки образцов

1. Заполните Spex 6850 морозильник мельница резервуар с жидким азотом и место воздействия бар в одном из шлифовальных флаконов и залить жидким азотом, предварительно охладить. Вылейте жидкий азот и добавить образец флаконе.
2. Убедитесь, что нет избытка жидкого азота остается в камере и фрезерные, что избыточный азот полностью вентилируемые до конца шапка сидит для герметизации камеры.
3. Вставьте шлифовальные чашу перевозчика и близко.
4. Милль древесных образцов для двух циклов 1 минута / цикл при нормировании до 14 лет.
5. Использование жидкого азота охлажденные лопаточкой, чтобы удалить фрезерованные образца (древесная мука) в стакан, который был предварительно охлажденных и содержит небольшое количество жидкого азота.
6. Залить жидким азотом / образец шлама в контейнер для хранения и месте при температуре -80 ° C до необходимости.

Часть 3: РНК Выделение, день 1

1. Место 20 мл буфера изоляции РНК в 50 мл ограничен трубки Сокол и добавить 400 мкл β-меркаптоэтанол, вихревые кратко, то тепла в 60 ° С водяной бане.
2. Добавить 4 г замороженной ткани в каждую пробирку. Кап и энергично встряхните руками следуют вортексе в течение 10 секунд.
3. Добавить равным объемом хлороформа к трубке, и инвертировать осторожно перемешать. Место трубки на вращающееся колесо и позволяет конечным сравнению с аналогичным периодом конца смешивания в течение 5 минут.
4. Декантируйте смесь в 50 мл Дуб трубки Ридж и центрифуге при 12 000 (17 200 мкг) оборотов в минуту в SS34 фиксированным углом ротора в течение 5 минут.
5. Передача водной фазы в новую пробирку Ок-Ридже и добавить половину объема хлороформа.
6. Vortex в течение 1 минуты и продолжить перемешивание на вращающееся колесо на 5 минут. Центрифуга при 12000 оборотов в минуту (17 200 мкг) в SS34 фиксированных угла ротора в течение 5 минут.
7. Передача водной фазы в новую пробирку Ок-Ридже и добавить половину объема хлороформа. Vortex в течение 1 минуты. Центрифуга при 12000 оборотов в минуту (17 200 мкг) в SS34 фиксированных угла ротора в течение 10 минут.
8. Передача водной фазы 50 мл высокой трубки полипропилена скорости. Центрифуга на 10000 оборотов в минуту (11 900 мкг) в фиксированной SS34 угла ротора в течение 20 минут.
9. Декантировать супернатанта в 50 мл трубки Сокол и добавить четверть объема 10 М LiCl решение супернатант. Кратко вихря и месте при температуре 4 ° С в течение ночи осадков.

Часть 4: РНК Выделение, 2-й день

1. Тепло SSTE буфера в 65 ° С водяной бане до начала.
2. Налейте LiCl-осажденный образца в трубке полипропилена и гранул РНК центрифугированием при 11000 оборотов в минуту в SS34 фиксированных угла ротора (14 450 мкг) в течение 30 минут при 4 ° C.
3. После центрифугированияслить и выбросить жидкость, и инвертировать трубок на Kimwipes в течение примерно 1 минуты. Внесите удаления оставшихся супернатант.
4. Ресуспендируют каждая гранула в 800 мкл подогревом SSTE с помощью пипетки для тщательного перемешивания образцов. Передача ресуспендировали образца 2 мл РНКазы Амбион без труб и отцентрифугировать.
5. Тепло образцов при 65 ° С в течение 2 минут с последующим энергичным вортексе для обеспечения полного ресуспендирования.
6. Добавить равным объемом фенол-хлороформ, PH8, к каждому образцу трубки. Vortex каждого образца в течение 30 секунд, а затем спина в микроцентрифужную при 14000 оборотов в минуту в течение 3 минут
7. Передача водной фазы нового Амбион 2 мл РНКазы без труб микроцентрифужную, а также добавить равным объемом хлороформа. Vortex каждого образца в течение 30 секунд, а спина в микроцентрифужную при 14000 оборотов в минуту в течение 3 минут.
8. Передача водной фазы в фазе-Lock гель трубы, которые были ранее подготовленные microfuging при 11000 оборотов в минуту в течение 2 минут. Добавить половину объема хлороформа и осторожно пипеткой перемешать.
9. Центрифуга при 11000 оборотов в минуту в течение 5 минут и передача водной фазы на свежий 2 мл РНКазы Амбион без труб и отцентрифугировать.

Часть 5: РНК осадков и этанола Вымойте

1. Добавить 50 мкл 3,0 М ацетата натрия, рН 4,8, и 1 мл 100% этанола в водную фазу. Vortex и выпадают в осадок в -80 ° С в течение 30 минут или на ночь при температуре -20 ° C.
2. Микроцентрифужную образцов при 14 000 оборотов в минуту в течение 30 минут при температуре 4 ° С, и тщательно аспирата с супернатант. Не беспокоить гранул.
3. Вымойте РНК гранулы с 1 мл -20 ° C 70% (объем / объем) этанола. Микроцентрифужную при 14000 оборотов в минуту в течение 1 минуты и аспирата с этанолом.
4. Повторите шаг 5.3.
5. Открывать труб и воздушно-сухих гранул на скамейке в течение 3-5 минут.

Часть 6: Заключительный ресуспендирования и количественной

1. Ресуспендируют каждая гранула в 100 мкл DEPC обработанной воды. Смешайте по вортексе и инкубировать пробирки при 65 ° С в течение 2 минут перед размещением на льду. Повторить, если необходимо обеспечить образец ресуспендирования.
2. Бассейн, как образцы при желании и сделать 50 мкл разведения 1:10 в 10 мМ Трис, рН 7,5, для количественного спектрофотометрического. Поглощение отношения для 260/280 и 260/230, как правило, больше чем в 2,1 и 2,2, соответственно. РНК изоляция дает диапазон от 60-120μg / г замороженной ткани.
3. Анализ образцов РНК работает 1,5-2,5 мкг на 1% агарозном геле в буфере ТАЕ. Для более критично образцы, анализ РНК с использованием Agilent 2100 Bioanalyzer в соответствии с инструкциями производителя.

Представитель Результаты:

РНК изоляции выходы из различных хвойных диапазон ткани от 60-120 мкг / г замороженной ткани с древесными образцы обычно приносит около 70-80г / г замороженной ткани. Диагностические отношения 260/280 и 260/230 являются обычно больше, чем 2.1, и замечаете, что образцы РНК без каких-либо значительных фенольного загрязнения или углеводов, соответственно. Образцы проанализировали на агарозном гель-электрофореза последующим окрашиванием EtBr должны показать три отдельных полос для 25S, 18S и 5S РНК (рис. 1). Определение стехиометрии 28S для 18S на агарозном гелях несколько субъективно, и факторы, такие как бег условия для геля, окрашивание, а также примеры нагрузка все это может иметь эффект. В общем, 28S: 18S соотношение будет выглядеть как> 1,5. Однако, некоторые хвойные образцы имеют более низкие коэффициенты. Например, после анализа Agilent 2100 мы видели несколько экземпляров хвойных образцов из различных типов ткани, где стехиометрии ближе к 1.2:1. Таким образом, явно низкий 28S: 18S стехиометрии помощью электрофореза в агарозном геле не обязательно свидетельствует о некачественной образца. Лист, стрелять, и конус образцы часто имеют дополнительные отдельных полос присутствовать из-за хлорпластического рибосомальной РНК. EtBr окрашенных материалов, которые не мигрируют из образца хорошо или высокой молекулярной массой полосы (> 8-10 кб) обычно указывают на загрязнение геномной ДНК (рис. 2). Низкая молекулярная масса мазков в районе или ниже 5S группы и снижение рибосомных окрашивания полосы или очевидной 18S> 28S стехиометрии является хорошим показателем, что РНК деградации произошло (рис. 3). В Agilent 2100 electropherogram анализа, основная линия должна быть низкой и относительно гладкие с крупными пики, соответствующие 18S и 28S рибосомных РНК с 28S: 18S отношения составляя от 1,2 до 2,0. Целостность Agilent РНК номер (РИН) значение может быть лучшим индикатором качества РНК и должно быть не менее 7 и более для РНК, которая будет использоваться для подготовки микрочипов целей. Рисунок 4 показывает типичный Agilent 2100 electropherogram для ксилемы РНК с 28S: 18S коэффициент, равный 1,4, а значение РИН в 8,6, а на рис 5 показана бедных ксилемы РНК приготовительные имеющие очень высокий базовый и заметной деградации как показал 28S: 18S раTiO равны 0,65 и RIN значение 3,4.

Рисунок 1. Агарозном геле анализ высококачественной РНК сосны. Лейн 1, NEB 1 кб стандарт, переулок 2 показан типичный полной изоляции РНК из ладанной сосны вторичная ксилемы с характерными рибосомной 28S, 18S и 5S групп и очевидной 28S: 18S соотношение> 1.

Рисунок 2. Агарозном геле анализ образцов сосны РНК загрязненных геномной ДНК. Лейн 1, NEB 1 кб стандарт, переулок 2, ксилемы РНК пример, демонстрирующий геномной ДНК загрязнения.

Рисунок 3. Агарозном геле анализ сосны пример, демонстрирующий РНК деградации и загрязнения геномной ДНК. Лейн 1, NEB 1 кб стандарт, Lane2, ксилемы РНК пример, демонстрирующий геномной ДНК и загрязнения тяжелыми деградации РНК.

Рисунок 4. Agilent 2100 electropherogram РНК ксилемы общего выделяли с помощью описанного метода на ладанной ксилемы сосны. 28S: 18S отношение равно 1,4, РИН значение равно 8,6

Рисунок 5. Agilent 2100 electropherogram апикального кончика общей РНК симптомами острого деградации и геномной загрязнения. 28S: 18S отношение равно 0,65, РИН значение равно 3,4

Discussion

Получение высококачественной РНК из хвойных пород может быть трудной задачей, учитывая высокий уровень фенольных соединений и полисахаридов найден в древесных тканях. Начиная с протокол, разработанный Chang и соавт. (1), мы обнаружили, что более строгий добыче и очистке ступени ведут к последовательной изоляции очень высокого качества общей РНК из различных древесных и недревесных тканей взятых из различных хвойных пород. Это видео показали не только нашей модифицированной РНК изоляции протоколу, но также шаги, предпринятые в полевого сбора и обработки методов, используемых для ладанной сосны до РНК изоляции. Эти заготовки и подготовительных шагов в равной степени важно свести к минимуму деградации РНК в полевых проб, а также для повышения качества как РНК, так и валовой сбор. Самое главное, мы обнаружили, что РНК подготовлен с использованием этого метода привело к увеличению синтеза кДНК дает по сравнению с другими методами подготовить микрочипов цели для гибридизации с PtGen2 ладанной сосны микрочипов (2).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA Isolation Buffer			2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine
Chloroform	Fisher Scientific	C298-4
Phenol, Ultrapure	Invitrogen	15509-037
10M LiCl			Made with DEPC-treated water
SSTE Buffer			1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)
Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8			Made with DEPC-treated water
Phenol-chloroform (pH8.0)			120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0
Oak Ridge High Speed Teflon Tubes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-16B
Polypropylene 50mL High Speed Tubes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-10K
BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes	VWR international	#21008-939
Phase Lock Gel Heavy, 2mL	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#2302830
Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL	Ambion	#AM12425