Определение Реакционная способность и титр сыворотки использованием гемагглютинации Пробирной

Summary

Гемагглютинации является одной из форм агглютинации, где антитела связываются с эритроцитами. Красные кровяные клетки являются как легко доступны и результаты легко наблюдаемых использованием невооруженным глазом. Это видео демонстрирует этапы гемагглютинации анализа, интерпретация результатов и определение титра.

Abstract

Гемагглютинации является специфической формой агглютинации и используется, когда антитела связываются с эритроцитами, которые действуют как частицы антигена. Красные кровяные клетки являются особенно полезными целями, поскольку они легко доступны и агглютинация наблюдается использованием невооруженным глазом. Этот метод обычно используется для определения титра антител (Ab), для групп крови и вирусным количественной оценке. В этом видео, этапы подготовки и проведения гемагглютинации анализа является продемонстрировать с помощью антител, специфичных к группе крови-антигенов добавлены в красных кровяных телец (Revercells). Антисыворотки серийно разводят в 96-U-нижний лоток для микротитрования, к которой добавляется суспензия Revercells. Образцы смешиваются, а затем инкубировали при 37 ° С в течение 60 минут. По истечении этого времени образцы могут быть легко забил за В.Е., положительные и промежуточных реакций (-/+) гемагглютинации. Такой подход позволяет реактивности и титр сыворотки, чтобы оценить, используя быстрый и простой метод. Видео будет охватывать Теория, лежащая анализа, как результаты читать и толковать, как титр определяется, как анализ может быть изменен и любые вопросы, связанные с использованием этой техники.

Protocol

Подготовка 5x веронал буферного раствора (VBS)

1. Для подготовки веронал буферного раствора (VBS), три отдельных решения должны быть подготовлены.
2. Подготовка раствора 1, растворяя 21.25gm из NaCl и 0.94gm натрия Barbitone в 350 мл дистиллированной воды. Конечные концентрации NaCl и натрия Barbitone являются 1.02M и 13 мм соответственно.
3. Подготовка раствора 2, растворяя 1.44gm из Barbitone в 125 мл горячей дистиллированной воды. Конечная концентрация Barbitone является 62.5mM.
4. Подготовка раствора 3, растворяя 20.33gm из MgCl ₂ и 4.41gm из CaCl ₂ в 100 мл дистиллированной воды. Конечной концентрации MgCl ₂ и CaCl _2, 2.18M и 440мм соответственно.
5. Смешайте растворы 1 и 2 и охладить до комнатной температуры.
6. После совместного решения остынет, добавить 1,25 мл раствора 3 и регулировать рН до 7.3-7.5 использованием 1М HCl.
7. Отрегулируйте конечного объема 500 мл дистиллированной воды для приготовления 5x маточного раствора.
8. Для подготовки 1x рабочий раствор, развести акции 1:05 дистиллированной водой.

Разбавление Revercells

1. Аккуратно ресуспендирования исходного раствора Revercells обращением, а затем удалить 1 мл клеток и центрифуги в течение 5 мин при 600 г при 4 ° C.
2. После центрифугирования, осторожно удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 3 мл 1x веронал солевой буфер.
3. Клетки теперь можно хранить при температуре 4 ° С до использования.

Процедура

1. Передача 50 мл 1x VBS в строки А1-А12 в 96 ячейках нижней U.
2. Чтобы Ну A1, добавить 50 мкл анти-сыворотки и тщательно перемешать с помощью пипетки.
3. Использование свежей кончика пипетки, удалить 50 мкл жидкости из скважины A1 и передать его хорошо А2. Тщательно перемешать и повторить этот процесс, пока не дойдете до хорошо A11, а затем отбросить последние 50 мкл из этого колодца.
4. Образца сыворотки в настоящее время серийно разбавленного в 2 раза от 1:2 до 1:2048. Нет сыворотки добавляют Ну A12 как это VBS отрицательного контроля.
5. Если более одного образца сыворотки должна быть оценена, повторите шаги 4.1-4.4 для строки B и т.д.
6. После того как все разведения были сделаны, добавить 50 мкл 1% Revercells во все лунки. Примечание: Revercells будет располагаться во времени и должны быть аккуратно приостановлено до того, как разливали в скважинах.
7. Смешайте образцы, аккуратно нажав на стороне лотка для микротитрования, накрыть крышкой и оставить гемагглютинации протекания реакции в течение 1 ч при 37 ° C. Инкубаторе или надлежащим образом отапливаемом помещении могут быть использованы.
8. После инкубации, осторожно снимите лоток из инкубатора и изучить пластина для гемагглютинации. Контроль VBS также должны быть рассмотрены первой скважины. Если реакция отрицательная, то результаты справедливы. Если образец VBS показывает положительный результат гемагглютинации, то результаты не могут быть использованы, и процесс должен быть повторен. Положительная реакция гемагглютинации будет выглядеть как широкий лист, на базе хорошо, а негативная реакция будет выглядеть как небольшая сосредоточены гранул клеток в центре хорошо. Промежуточный результат будет положительный ореол клетки с центральным ядром гранулированных клеток. Этот результат возникает в сыворотке имеет некоторые Ab, которые могут реагировать, но недостаточное количество Ab вызвать полную реакцию.
9. Представитель разделе результатов имеет две схематические представления ожидаемых результатов. Например, недопустимыми и допустимый набор результатов обеспечивается. Титр для анти-сыворотки будет также определяться.

Представитель Результаты:

Видео включает в себя пример представителя результаты. Ниже (Рис1 и рис 2) приведены два примера показано на схематической форме. Первый пример реакции, которые не могут быть истолкованы как контроль VBS является положительным, а второй является допустимым анализа, который позволяет титр не определена.

Рисунок 1. Пример гемагглютинации, где положительный результат не удалось. В схематическое изображение выше, heamagglutination реакция не может быть принято. VBS сыворотки отрицательный контроль показывает положительную реакцию гемагглютинации, о чем свидетельствует лист формирование на базе хорошо. Это означает, что произошла ошибка, и результаты не могут быть приняты. В этом случае процесс должен быть повторен.

Рисунок 2. Пример гемагглютинации, где положительный результат работал правильно. В схематическое изображение, heamagglutination реакции является действительным. VBS отрицательный контроль показывает негативную реакцию гемагглютинациис свидетельствует гранул, которая формируется на базе хорошо. Последние положительные и по строкам 7, который показывает, что для этого титра сыворотки проба 128 (то есть взаимное 1 / 128). Это был бы пример антитела, которые присутствуют в умеренных количествах в сыворотке крови.

Discussion

Гемагглютинации анализа является очень простой метод, который позволяет для большого числа образцов сыворотки крови следует оценивать в течение короткого периода времени. Она также имеет то преимущество, что читать без необходимости специализированного оборудования, с глазу пригодные. Этот метод также может быть модифицирован для обнаружения человеческого хорионического гормона гонадотропина в моче, как часть гемагглютинации ингибирования тест. По отношению к стандартным тестом гемагглютинации, Есть несколько областей, где уход должны быть приняты для того, чтобы анализ должны быть выполнены правильно. Во-первых, этот метод основан на решении клеток на вогнутой поверхности. Таким образом, важно, что U-или круглым дном планшет используется. Использование плоской пластине нижней, как обычно используется для ИФА не подходит, как отрицательные и положительные реакции появятся одинаковые. Следует также отметить, что, когда различные образцы сыворотки используются, реагирующих антител, вероятно, будут присутствовать на различных концентрациях. При высокой концентрации антител, антигена (Revercells), могут быть ограничения и эффект прозоны могут быть соблюдены. Однако это не повлияет на определение значения титра, так как это определяется как последние хорошо, где положительная реакция в последний раз видели. И наконец, эта методика не количественные, абсолютный уровень реактивной антител в сыворотке крови не известно. Тем не менее, в большинстве случаев это не является необходимым, особенно когда определение реактивности к известным антиген всю информацию, которая требуется.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Revercells	CSL	02490201	Use at 1% final
Anti-A serum	CSL	02611305
96 well U bottom plate	TRP	92097	Must be U-bottom
Veronal buffered saline			Use at 1x final
37°C room/incubator
Disposable gloves