Fastställande av reaktivitet och titer av serum med hjälp av en hemagglutination analys

Summary

Hemagglutination är en form av agglutination där antikroppar binder till röda blodkroppar. Röda blodkroppar är både lättillgängliga och resultaten är lätt iakttas med blotta ögat. Denna video visar de olika stegen i ett hemagglutinations analys, tolka resultaten och bestämma titern.

Abstract

Hemagglutination en särskild form av agglutination och används när antikroppar binder till röda blodkroppar, som fungerar som en partikel-antigen. Röda blodkroppar är särskilt användbara mål som de är lätt tillgängliga och agglutination observeras med blotta ögat. Denna teknik används ofta för att bestämma titern av en antikropp (AB), för blodgruppering och virala kvantifiering. I den här videon är steg i att förbereda och utföra en hemagglutination analys visade med hjälp av antikroppar specifika för blodgrupp A-antigener läggs till röda blodkroppar (Revercells). Antiserumet är seriellt utspätt i en 96 och U-botten mikrotiterplattor bricka, som läggs till en suspension av Revercells. Proverna blandas och sedan inkuberas vid 37 ° C i 60 minuter. Efter denna tid kan proverna sedan lätt poäng för ve, + ve och mellanliggande (-/+) reaktioner hemagglutinerande. Detta tillvägagångssätt möjliggör reaktivitet och titer av ett serumprov som skall utvärderas med hjälp av en snabb och enkel teknik. Videon kommer att täcka teorin bakom analysen, hur resultaten läsas och tolkas, hur titer bestäms, hur analysen kan ändras och eventuella problem i samband med användning av denna teknik.

Protocol

Beredning av 5x buffrat Veronal saltlösning (VBS)

1. För att förbereda Veronal saltlösning (VBS), tre separata lösningar behöver förberedas.
2. Bered en genom att lösa 21.25gm av NaCl och 0.94gm av Sodium SÖMNMEDEL i 350 ml destillerat vatten. Den slutliga koncentrationen av NaCl och Natrium SÖMNMEDEL är 1,02 m och 13 mm respektive.
3. Bered 2 genom att lösa 1.44gm av SÖMNMEDEL i 125ml hett destillerat vatten. Den slutliga koncentrationen av SÖMNMEDEL är 62.5mM.
4. Bered 3 genom att lösa 20.33gm av MgCl ₂ och 4.41gm av CaCl ₂ i 100 ml destillerat vatten. Den slutliga koncentrationen av MgCl ₂ och CaCl ₂ är 2.18M och 440 respektive.
5. Blanda lösningar 1 och 2 och svalna till rumstemperatur.
6. När den kombinerade lösningen har svalnat, tillsätt 1,25 ml av lösning 3 och justera pH till 7,3-7,5 med 1M HCl.
7. Justera den slutliga volymen till 500 ml med destillerat vatten för att förbereda en 5x stamlösning.
8. För att förbereda en 1x fungerande lösning, späd beståndet 1:05 med destillerat vatten.

Spädning av Revercells

1. Försiktigt resuspendera stamlösningen av Revercells genom inversion och ta sedan bort 1 ml av celler och centrifugera i 5 minuter vid 600g vid 4 ° C.
2. Efter centrifugering, försiktigt bort supernatanten och suspendera cellerna i 3 ml 1X Veronal saltlösning.
3. Cellerna kan nu lagras vid 4 ° C fram till användning.

Förfarande

1. Överför 50 ml 1X VBS i rader A1-A12 med en 96 och U-bottenplatta.
2. Väl A1, lägga 50μl av anti-A-serum och blanda noggrant med en pipett.
3. Med hjälp av en ny pipettspets, ta bort 50μl av vätska från såväl A1 och överföra den till bra A2. Blanda väl och upprepa processen tills du kommer väl A11 och sedan kasta den sista 50μl från detta väl.
4. Serumprovet har nu serie utspädd 2-faldigt från 1:02 till 1:2048. Ingen serum tillsätts Jo A12 eftersom det är det VBS negativ kontroll.
5. Om mer än ett serum provet skall bedömas, upprepa steg 4,1-4,4 för rad B etc.
6. När alla spädningar har gjorts, lägga 50μl på 1% Revercells i alla brunnar. Obs: Revercells nöjer över tid och bör vara försiktigt avbrytas innan den droppats in i brunnar.
7. Blanda proverna genom att försiktigt knacka på sidan av mikrotiterplattor facket, lock och lämna haemagglutination reaktionen fortsätta i 1h vid 37 ° C. En inkubator eller lämpligt uppvärmt rum kan användas.
8. Efter inkubation, försiktigt bort brickan från kuvösen och undersöka plåt för hemagglutination. VBS kontrollbrunnen bör den första brunnen undersöktes. Om reaktionen är negativ, då resultaten är giltiga. Om VBS provet visar ett positivt hemagglutination resultat, då resultaten inte kan användas och processen bör upprepas. En positiv hemagglutination reaktion kommer att visas som en bred plåt i botten av brunnen, medan en negativ reaktion kommer att synas som en liten koncentrerad pellet av cellerna i mitten av väl. Ett mellanliggande resultat kommer att ha en gloria av positiva celler med en central kärna av pelleterat celler. Detta resultat inträffar som serum har några Ab som kan reagera, men otillräcklig mängd Ab för att orsaka en fullständig reaktion.
9. Den representativa resultat delen har två diagram representationer av de förväntade resultaten. Ett exempel på en ogiltig och giltig uppsättning resultat tillhandahålls. Titern för den anti-serum kommer också att fastställas.

Representativa resultat:

Videon innehåller ett exempel på representativa resultat. Nedan (Fig 1 och Fig 2) är två exempel visas i diagramform sätt. Det första exemplet är en reaktion som inte kan tolkas som VBS kontroll är positiv, medan den andra är en giltig analys som tillåter titern som skall bestämmas.

Figur 1. Ett exempel på en hemagglutination där det positiva resultatet har misslyckats. I diagram representation ovan kan heamagglutination reaktionen inte accepteras. VBS serum negativa kontrollen visar en positiv haemagglutination reaktion vilket framgår av bladet bildas vid basen av brunnen. Detta indikerar att ett fel har uppstått och resultaten kan inte accepteras. I detta fall bör processen göras om.

Figur 2. Ett exempel på en hemagglutination där det positiva resultatet har fungerat korrekt. I diagram representation, är heamagglutination reaktionen giltigt. VBS negativa kontrollen visar en negativ hemagglutinerande reaktion enar framgår av pellets som har bildats vid basen av brunnen. Den sista positiva är väl rad 7, vilket indikerar att titern för denna serumprovet är 128 (dvs. ömsesidig på 1 / 128). Detta skulle vara ett exempel på en antikropp som finns i måttliga mängder i serum.

Discussion

Den hemagglutination-analysen är en mycket enkel teknik som möjliggör ett stort antal serumprover ska bedömas inom en kort tidsperiod. Det har också fördelen av att vara läst utan behov av specialutrustning, med ögat är lämplig. Denna teknik kan också ändras för detektering av humant koriongonadotropin som finns i urinen, som en del av en hemagglutinationinhibitionstestet. I förhållande till en standard hemagglutination test, finns det några områden där vården måste vidtas för att analysen ska utföras korrekt. För det första är denna teknik bygger på reglering av cellerna på en konkav yta. Som sådan är det viktigt att ett U-eller rund botten mikrotiterplatten används. Användningen av en flat bottenplatta som ofta används för ELISA är inte lämpligt, som negativa och positiva reaktioner kommer att visas identiska. Det bör också vara medveten om att när olika serumprov används antikroppar kommer sannolikt att vara närvarande vid olika koncentrationer. Vid höga koncentrationen av antikroppar kan det antigen (Revercells) vara begränsande och en prozoneffekt effekt kan observeras. Dock kommer detta inte att påverka bestämningen av titern värde, eftersom detta avgörs som den sista och där en positiv reaktion sågs senast. Slutligen är denna teknik inte är kvantitativa, är den absoluta nivån av reaktiva antikroppar i serum inte känd. Men i de flesta fall är detta inte nödvändigt, särskilt när fastställandet av reaktivitet till ett känt antigen är all den information som krävs.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Revercells	CSL	02490201	Use at 1% final
Anti-A serum	CSL	02611305
96 well U bottom plate	TRP	92097	Must be U-bottom
Veronal buffered saline			Use at 1x final
37°C room/incubator
Disposable gloves