Immunology and Infection

जेट और सीरम के Titre एक Haemagglutination परख का उपयोग कर निर्धारण

Published: January 29, 2010 doi: 10.3791/1752

¹School of Pharmacy and Medical Sciences, University of South Australia

Summary

Haemagglutination समूहन के एक फार्म जहां एंटीबॉडी लाल रक्त कोशिकाओं के लिए बाध्य है. लाल रक्त कोशिकाओं दोनों आसानी से उपलब्ध हैं और परिणाम आसानी से नग्न आंखों का उपयोग नमूदार हैं. यह वीडियो एक haemagglutination परख में शामिल कदम दर्शाता है, परिणामों की व्याख्या और titre निर्धारण.

Abstract

Haemagglutination समूहन का एक विशिष्ट रूप है और प्रयोग किया जाता है जब एंटीबॉडी लाल रक्त कोशिकाओं है, जो एक कण प्रतिजन के रूप में कार्य करने के लिए बाध्य है. लाल रक्त कोशिकाओं को विशेष रूप से उपयोगी लक्ष्य कर रहे हैं के रूप में वे आसानी से उपलब्ध हैं और समूहन नग्न आंखों का उपयोग करने के लिए प्रत्यक्ष है. इस तकनीक सामान्यतः एक एंटीबॉडी titre (अब) रक्त समूहीकरण और वायरल मात्रा का ठहराव के लिए, निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस वीडियो में, तैयारी और प्रदर्शन एक haemagglutination परख में शामिल कदम रक्त समूह A-एंटीजन लाल रक्त कोशिकाओं (Revercells) जोड़ी के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए प्रदर्शन किया है. antiserum serially एक 96 अच्छी तरह से यू - नीचे microtitre ट्रे में पतला है, जो Revercells के निलंबन जोडी. नमूने मिश्रित और फिर 60 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस 37 पर incubated. इस समय के बाद, नमूने तो आसानी से किया है, + ve और मध्यवर्ती (-/+) haemagglutination प्रतिक्रियाओं के लिए कर सकते हैं बने हो. इस दृष्टिकोण जेट और एक सीरम नमूने की एक तेजी से और सरल तकनीक का उपयोग कर मूल्यांकन किया titre के लिए अनुमति देता है. वीडियो परख के पीछे सिद्धांत, कैसे परिणाम पढ़ सकते हैं और व्याख्या कर रहे हैं, कैसे titre निर्धारित किया जाता है, कैसे परख संशोधित किया जा सकता है और किसी भी इस तकनीक का उपयोग के साथ जुड़े मुद्दों को कवर किया जाएगा.

Protocol

5x Veronal buffered खारा (VBS) की तैयारी

Veronal buffered खारा (VBS) तैयार करने के लिए, तीन अलग अलग समाधान करने के लिए तैयार रहने की जरूरत है.
आसुत पानी की 350ml में NaCl और सोडियम Barbitone के 0.94gm 21.25gm भंग द्वारा तैयार समाधान 1. NaCl और सोडियम Barbitone के अंतिम सांद्रता 1.02M और 13mm क्रमशः रहे हैं.
2 गर्म आसुत पानी की 125ml में Barbitone के 1.44gm भंग करके समाधान तैयार करें. Barbitone के अंतिम एकाग्रता 62.5mM है.
आसुत पानी की 100ml में ₂ MgCl और CaCl ₂ के 4.41gm 20.33gm भंग से 3 समाधान तैयार करें. ₂ MgCl और CaCl ₂ के अंतिम एकाग्रता 2.18M और 440mM क्रमशः है.
मिक्स 1 और 2 समाधान और कमरे के तापमान शांत करने के लिए.
एक बार संयुक्त समाधान ठंडा है, 3 समाधान के 1.25 मिलीलीटर जोड़ने और पीएच 7.3-7.5 1M एचसीएल का उपयोग करने के लिए समायोजित.
आसुत जल के साथ 500ml के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करने के लिए एक 5x शेयर समाधान तैयार है.
एक 1x काम कर समाधान तैयार करने के लिए, आसुत जल के साथ शेयर 01:05 पतला.

Revercells के कमजोर पड़ने

धीरे उलटा द्वारा Revercells के शेयर समाधान resuspend और तो 4 में 5 मिनट के लिए कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र के 1ml 600g पर हटायें डिग्री सेल्सियस
Centrifugation के बाद, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला 3ml 1x में कोशिकाओं को हटाने और resuspend Veronal खारा buffered.
कोशिकाओं को अब 4 बजे ° उपयोग करें जब तक सी संग्रहित किया जा सकता है.

प्रक्रिया

A1: A12 पंक्तियों में एक 96 अच्छी तरह से यू नीचे की थाली के 50ml 1x VBS के स्थानांतरण.
खैर A1 करने के लिए, विरोधी एक सीरम 50μl जोड़ने और मिश्रण अच्छी तरह से एक विंदुक का उपयोग.
एक ताजा विंदुक टिप का उपयोग करना, A1 से अच्छी तरह से तरल के 50μl हटा दें और इसे अच्छी तरह से A2 करने के लिए स्थानांतरण. अच्छी तरह मिक्स और इस प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक आप अच्छी तरह से A11 तक पहुँचने और फिर यह अच्छी तरह से पिछले 50μl त्यागें.
सीरम नमूना serially अब किया गया है 01:02 से 1:2048 करने के लिए 2 गुना पतला है. सीरम A12 खैर नहीं जोड़ा जाता है के रूप में इस VBS नकारात्मक नियंत्रण है.
यदि एक से अधिक सीरम नमूना मूल्यांकन किया है, दोहराने चरण आदि बी पंक्ति के लिए 4.1-4.4
एक बार सभी dilutions किया गया है, सभी कुओं 50μl 1% Revercells के जोड़. नोट: Revercells समय बसने और धीरे से कुओं में तिरस्कृत किया जा रहा है होना चाहिए पहले निलंबित कर दिया.
Microtitre ट्रे की तरफ धीरे दोहन द्वारा नमूने मिश्रण को कवर, और haemagglutination 37 पर 1 के लिए आगे बढ़ना प्रतिक्रिया डिग्री सेल्सियस छोड़ एक इनक्यूबेटर या उचित गर्म कमरे में इस्तेमाल किया जा सकता है.
ऊष्मायन के बाद, ध्यान इनक्यूबेटर से ट्रे को हटा दें और haemagglutination के लिए थाली की जांच. VBS नियंत्रण अच्छी तरह से पहले अच्छी तरह जांच होना चाहिए. अगर प्रतिक्रिया नकारात्मक है, तो परिणाम मान्य हैं. यदि VBS नमूना एक सकारात्मक haemagglutination परिणाम से पता चलता है, तो परिणाम और उपयोग नहीं किया प्रक्रिया को दोहराया जाना चाहिए कर सकते हैं. एक सकारात्मक haemagglutination प्रतिक्रिया के आधार पर अच्छी तरह से एक व्यापक पत्रक के रूप में दिखाई देते हैं, जबकि एक नकारात्मक प्रतिक्रिया कोशिकाओं के एक छोटे केंद्रित गोली के रूप में अच्छी तरह के केंद्र में दिखाई देगा. एक मध्यवर्ती परिणाम pelleted कोशिकाओं के एक केंद्रीय कोर के साथ सकारात्मक कोशिकाओं के एक प्रभामंडल होगा. यह परिणाम के रूप में सीरम कुछ अब है कि प्रतिक्रिया कर सकते हैं होता है, लेकिन अब की अपर्याप्त मात्रा के लिए एक पूर्ण प्रतिक्रिया के कारण.
प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में परिणाम की उम्मीद के दो ढांचे के रूप में निरूपण है. परिणामों की एक अवैध और वैध सेट का एक उदाहरण प्रदान की गई है. titre विरोधी सीरम के लिए भी निर्धारित किया जाएगा.

प्रतिनिधि परिणाम:

वीडियो प्रतिनिधि के परिणाम का एक उदाहरण भी शामिल है. नीचे Fig1 और (चित्र 2) एक ढांचे के रूप में तरीके से दिखाया गया है दो उदाहरण हैं. पहला उदाहरण एक प्रतिक्रिया है कि VBS नियंत्रण के रूप में सकारात्मक है व्याख्या नहीं की जा है, जबकि दूसरा एक वैध परख है कि निर्धारित किया जा titre के लिए अनुमति देता है.

चित्रा 1. Haemagglutination की एक उदाहरण है, जहां सकारात्मक परिणाम में नाकाम रही है. ऊपर ढांचे के रूप में प्रतिनिधित्व में, heamagglutination प्रतिक्रिया को स्वीकार नहीं किया जा सकता है. VBS सीरम नकारात्मक एक सकारात्मक haemagglutination प्रतिक्रिया के रूप में अच्छी तरह के आधार पर चादर गठन द्वारा evidenced नियंत्रण प्रदर्शित करता है. यह इंगित करता है कि एक त्रुटि हुई है और परिणाम स्वीकार किए जाते हैं नहीं किया जा सकता है. इस मामले में, इस प्रक्रिया को दोहराया जाना चाहिए.

चित्रा 2. Haemagglutination जहां सकारात्मक परिणाम सही ढंग से काम किया है की एक उदाहरण. ढांचे के रूप में प्रतिनिधित्व में, heamagglutination प्रतिक्रिया मान्य है. VBS नकारात्मक नियंत्रण एक नकारात्मक haemagglutination प्रतिक्रिया दिखाता हैगोली है कि अच्छी तरह के आधार पर गठन किया गया है द्वारा evidenced है. पिछले सकारात्मक अच्छी तरह से 7 पंक्ति है जो इंगित करता है कि इस सीरम के नमूने के लिए titre 128 (यानी 128 / 1 के पारस्परिक) है. यह एक एंटीबॉडी है कि सीरम में मध्यम मात्रा में मौजूद है की एक उदाहरण होगा.

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Discussion

haemagglutination परख एक बहुत ही सरल तकनीक है कि सीरम नमूनों की एक बड़ी संख्या के लिए समय की एक छोटी अवधि के भीतर मूल्यांकन किया के लिए अनुमति देता है. यह भी उपयुक्त आँख के साथ जा रहा है विशेष उपकरणों की आवश्यकता के बिना पढ़ा जा रहा का लाभ है. मानव chorionic gonadotrophin मूत्र में मौजूद हार्मोन का पता लगाने के के लिए इस तकनीक को भी संशोधित कर सकते हैं haemagglutination निषेध एक परीक्षण के हिस्से के रूप में हो. एक मानक haemagglutination परीक्षण के संबंध में, वहाँ कुछ क्षेत्र हैं जहां देखभाल करने के लिए सही ढंग से प्रदर्शन किया जा परख के लिए क्रम में लिया जाना चाहिए रहे हैं. सबसे पहले, इस तकनीक का एक अवतल सतह पर कोशिकाओं के निपटाने के पर आधारित है. जैसे, यह आवश्यक है कि एक यू या दौर नीचे microtitre प्लेट का प्रयोग किया जाता है. एक फ्लैट नीचे की थाली के उपयोग के रूप में सामान्यतः एलिसा के लिए प्रयोग किया जाता है उपयुक्त नहीं है, के रूप में नकारात्मक और सकारात्मक प्रतिक्रियाओं के समान दिखाई देगा. यह भी सराहना की कि जब विभिन्न सीरम नमूनों का इस्तेमाल कर रहे हैं, प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी अलग सांद्रता में मौजूद होने की संभावना है किया जाना चाहिए. उच्च एंटीबॉडी एकाग्रता, प्रतिजन (Revercells) और सीमित हो सकता है एक prozone प्रभाव मनाया जा सकता है. हालांकि इस titre मूल्य के निर्धारण को प्रभावित नहीं, क्योंकि यह अच्छी तरह से पिछले है, जहां एक सकारात्मक प्रतिक्रिया अंतिम बार देखा गया था जा रहा है के रूप में निर्धारित किया जाता है जाएगा. अन्त में, इस तकनीक का मात्रात्मक नहीं है, सीरम में प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी के निरपेक्ष स्तर ज्ञात नहीं है. हालांकि, ज्यादातर मामलों में यह आवश्यक नहीं है, खासकर जब जेट के एक प्रतिजन के लिए जाना जाता निर्धारण आवश्यक है कि सभी जानकारी है.

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Acknowledgments

लेखक और छायांकन के लिए तकनीक श्री पॉल शेफर्ड के प्रदर्शन के लिए मिस Lora मैथ्यू धन्यवाद देना चाहूंगा. इस परियोजना दक्षिण ऑस्ट्रेलिया के विश्वविद्यालय, प्रयोगशाला मेडिसिन प्रोग्राम द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Revercells	CSL	02490201	Use at 1% final
Anti-A serum	CSL	02611305
96 well U bottom plate	TRP	92097	Must be U-bottom
Veronal buffered saline			Use at 1x final
37°C room/incubator
Disposable gloves