Die Bestimmung der Reaktivität und Titre von Serum mit einem Hämagglutinations Assay

Summary

Hämagglutinations ist eine Form der Agglutination, wo Antikörper binden an roten Blutkörperchen. Rote Blutkörperchen sind beide verfügbar und die Ergebnisse sind leicht beobachtbaren mit dem bloßen Auge. Dieses Video zeigt die Schritte in einer Hämagglutination Test beteiligt sind, die Interpretation der Ergebnisse und die Bestimmung der Titer.

Abstract

Hämagglutinations ist eine spezifische Form der Agglutination und wird verwendet, wenn Antikörper gegen rote Blutkörperchen, die als Partikel Antigen wirken zu binden. Rote Blutkörperchen sind besonders nützlich, Ziele, da sie leicht verfügbar sind und die Agglutination zu beobachten ist mit dem bloßen Auge. Diese Technik wird häufig verwendet, um den Titer eines Antikörpers (Ab), für die Blutgruppenbestimmung und virale Quantifizierung zu bestimmen. In diesem Video werden die Schritte bei der Vorbereitung und Durchführung einer Hämagglutination Test beteiligten demonstriert mit spezifischen Antikörpern gegen Blutgruppe A-Antigene hinzugefügt, um rote Blutkörperchen (Revercells). Das Antiserum wird seriell in eine 96-Well U-Boden Mikrotiterplatten Tablett verdünnt, an dem eine Aussetzung der Revercells aufgenommen. Die Proben werden gemischt und dann bei 37 ° C für 60 Minuten. Nach dieser Zeit können die Proben dann leicht ve, + ve und Zwischenprodukte (-/+) Hämagglutination Reaktionen erzielt werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Reaktivität und die Titer von einer Serumprobe zu beurteilen mit einem schnellen und einfachen Technik. Das Video nimmt die Theorie hinter der Test, wie die Ergebnisse gelesen und interpretiert, wie der Titer bestimmt wird, wie der Test geändert werden können und alle Probleme mit dem Einsatz dieser Technik verbunden sind.

Protocol

Vorbereitung von 5x Veronal Buffered Saline (VBS)

1. Zur Vorbereitung der Veronal-gepufferte Kochsalzlösung (VBS), müssen drei separate Lösungen vorbereitet werden.
2. Bereiten Sie die Lösung 1 durch Auflösen 21.25gm von NaCl und 0.94gm von Sodium barbiturathaltiges Mittel in 350ml destilliertem Wasser. Die Endkonzentrationen der NaCl und Natrium barbiturathaltiges Mittel sind 1,02 M und 13mm bzw..
3. Bereiten Sie die Lösung 2 durch Lösen 1.44gm von barbiturathaltiges Mittel in 125ml destilliertem Wasser heiß. Die Endkonzentration der barbiturathaltiges Mittel ist 62.5mm.
4. Bereiten Lösung 3 durch Auflösen 20.33gm von MgCl ₂ und 4.41gm von CaCl ₂ in 100 ml destilliertem Wasser. Die Endkonzentration von MgCl ₂ und CaCl ₂ ist 2,18 m und 440 jeweils.
5. Mix-Lösungen 1 und 2 und auf Raumtemperatur abkühlen.
6. Sobald die kombinierte Lösung abgekühlt ist, fügen Sie 1,25 ml Lösung 3 und pH-Wert auf 7,3-7,5 mit 1 M HCl.
7. Passen Sie das endgültige Volumen auf 500 ml mit destilliertem Wasser auf einem 5-fach Stammlösung.
8. So bereiten Sie eine 1x funktionierende Lösung, verdünnte die Aktie im Verhältnis 1:5 mit destilliertem Wasser.

Eine Verwässerung des Revercells

1. Vorsichtig resuspendieren Stammlösung Revercells durch Inversion, und entfernen Sie dann 1 ml Zellen und zentrifugieren Sie für 5 min bei 600g bei 4 ° C.
2. Nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml 1x Veronal Kochsalzlösung.
3. Die Zellen können nun bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.

Verfahren

1. Transfer 50ml 1x VBS in Zeilen A1-A12 von einer 96-well U Bodenplatte.
2. Um Well A1, fügen Sie 50 ul Anti-A Serum und gründlich mit Hilfe einer Pipette.
3. Mit einer frischen Pipettenspitze entfernen 50 ul von Flüssigkeit aus gut A1 und überträgt es auf gut A2. Gründlich mischen und wiederholen Sie diesen Vorgang, bis Sie auch A11 und erreichen dann verwerfen Sie die letzten 50 ul aus dieser Quelle.
4. Die Serumprobe wurde nun seriell 2-fach von 1:2 bis 1:2048 verdünnt. Kein Serum ist Well A12 aufgenommen, da dies die VBS negative Kontrolle.
5. Wenn mehr als eine Serumprobe zu beurteilen ist, wiederholen Sie die Schritte 4,1-4,4 für Zeile B etc.
6. Sobald alle Verdünnungen gemacht worden sind, fügen Sie 50 ul 1% Revercells in alle Vertiefungen. Hinweis: Die Revercells wird zufrieden über die Zeit und sollte vorsichtig suspendiert werden, bevor in die Vertiefungen verteilt.
7. Mischen Sie die Proben durch leichtes Antippen auf der Seite der Mikrotiterplatte Tray, Deckel und lassen Sie die Hämagglutination Reaktion für 1 Stunde bei 37 ° C. Ein Inkubator oder entsprechend beheizten Raum genutzt werden kann.
8. Nach der Inkubation vorsichtig das Tablett aus dem Inkubator und untersuchen Sie die Platte auf Hämagglutination. Die VBS-Steuerung und sollte die erste gut untersucht werden. Wenn die Reaktion negativ ist, dann sind die Ergebnisse gültig sind. Wenn das VBS Beispiel zeigt eine positive Hämagglutination Ergebnis, dann können die Ergebnisse nicht verwendet werden und der Prozess muss wiederholt werden. Eine positive Hämagglutination Reaktion wird ein breites Blatt, auf der Basis der gut erscheinen, während eine negative Reaktion wird als kleines konzentrierten Pellets von Zellen in der Mitte der gut erscheinen. Ein Zwischenergebnis wird eine Halo-positive Zellen mit einem zentralen Kern von pelletierten Zellen. Dieses Ergebnis kommt als das Serum hat einige Ab, dass reagiert werden kann, aber nicht hinreichende Mengen von Ab, eine vollständige Reaktion zu verursachen.
9. Die repräsentativen Ergebnisse Abschnitt hat zwei schematische Darstellungen von den erwarteten Ergebnissen. Ein Beispiel für eine ungültige und gültige Satz von Ergebnissen ist. Der Titer der Anti-Serum wird ebenfalls bestimmt werden.

Repräsentative Ergebnisse:

Das Video enthält ein Beispiel für repräsentative Ergebnisse. Unten (Abb. 1 und Abb. 2) sind zwei Beispiele in schematischer Weise dargestellt. Das erste Beispiel ist eine Reaktion, die nicht interpretiert werden können, wie das VBS Kontrolle positiv ist, während der zweite ist ein gültiger Test, der für die Titer bestimmt werden können.

Abbildung 1. Ein Beispiel für eine Hämagglutination, wo das positive Ergebnis ist fehlgeschlagen. In der schematischen Darstellung erwähnt, kann die heamagglutination Reaktion nicht akzeptiert werden. Das VBS Serum negative Kontrolle zeigt eine positive Hämagglutination Reaktion, wie durch die Blattbildung auf der Basis der gut belegt. Dies deutet darauf hin, dass ein Fehler aufgetreten ist und die Ergebnisse können nicht akzeptiert werden. In diesem Fall sollte der Vorgang wiederholt werden.

Abbildung 2. Ein Beispiel für eine Hämagglutination, wo das positive Ergebnis korrekt gearbeitet hat. In der schematischen Darstellung ist die heamagglutination Reaktion gültig. Das VBS negative Kontrolle zeigt eine negative Reaktion eine Hämagglutinations durch die Pellets, die auf der Basis der gut geformt hat nachgewiesen. Der letzte positive gut Zeile 7, was bedeutet, dass der Titer dieser Serumprobe 128 (dh der reziproke Wert 1 / 128) angibt. Dies wäre ein Beispiel für einen Antikörper, der in moderaten Mengen im Serum ist.

Discussion

Die Hämagglutination-Assay ist eine sehr einfache Technik, die für eine große Anzahl von Serumproben, um innerhalb kurzer Zeit beurteilt werden können. Es hat auch den Vorteil, dass ohne die Notwendigkeit spezieller Ausrüstung zu lesen, mit dem Auge geeignet. Diese Technik kann auch für den Nachweis von humanem Chorion-Gonadotropin Hormon im Urin modifiziert werden, als Teil einer Hämaglutinationshemmungstest. In Bezug auf einen Standard Hämagglutinationstest, es gibt ein paar Bereiche, in denen darauf zu, um für den Test korrekt durchgeführt wird, haben muss. Erstens ist diese Technik auf die Ansiedlung von Zellen auf eine konkave Oberfläche. Als solches ist es wichtig, dass ein U-oder Rundboden-Mikrotiterplatte verwendet wird. Die Verwendung einer ebenen Bodenplatte wie allgemein für ELISA verwendet wird, nicht geeignet, da negative und positive Reaktionen erscheint identisch. Es sollte auch angemerkt, dass, wenn verschiedene Serumproben verwendet werden, reaktive Antikörper wahrscheinlich in unterschiedlichen Konzentrationen vorhanden sind. Bei hohen Antikörper-Konzentration kann das Antigen (Revercells) einschränkend und Prozonenphänomen beobachtet werden kann. Dies wird jedoch keinen Einfluss auf die Bestimmung der Titer-Wert, da diese als letzte auch, wo eine positive Reaktion zuletzt gesehen wurde bestimmt wird. Schließlich wird diese Technik nicht quantitative, ist die absolute Höhe der reaktiven Antikörper im Serum nicht bekannt. Doch in den meisten Fällen ist dies nicht notwendig ist, insbesondere, wenn die Bestimmung der Reaktivität auf ein bekanntes Antigen alle Informationen, die erforderlich ist.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Revercells	CSL	02490201	Use at 1% final
Anti-A serum	CSL	02611305
96 well U bottom plate	TRP	92097	Must be U-bottom
Veronal buffered saline			Use at 1x final
37°C room/incubator
Disposable gloves