Hemaglütinasyon Testi kullanarak Reaktivite ve Serum Titre Belirlenmesi

Summary

Hemaglütinasyon antikorlar kırmızı kan hücrelerinin bağlamak aglütinasyon şeklidir. Kırmızı kan hücreleri de hazır ve sonuçları çıplak gözle kolayca gözlemlenebilir. Bu video sonuçları yorumlama ve titre belirlenmesi, hemaglutinasyon tayininde yer alan adımları göstermektedir.

Abstract

Hemaglütinasyon aglütinasyon belirli bir biçimi ve antikorlar, bir parçacık antijen olarak hareket kırmızı kan hücreleri, bağladığınızda kullanılır. Kırmızı kan hücreleri, bunlar da hazır olarak özellikle yararlı hedefler ve aglütinasyon çıplak gözle kullanarak gözlemlenebilir. Bu teknik genellikle kan gruplama ve viral kantifikasyon bir antikor titresi (Ab) belirlemek için kullanılır. Bu video, hemaglutinasyon tahlil hazırlanması ve sahne alan adımları spesifik antikorlar kan grubu A-antijenleri, kırmızı kan hücreleri (Revercells) gösterilmiştir. Antiserum, seri Revercells bir süspansiyon eklendi hangi, iyi bir 96 U-alt mikrotitre tepsi seyreltilir. Örnekleri 60 dakika karıştırılır ve daha sonra 37 ° C'de inkübe. Bu süreden sonra, örnekleri daha sonra kolayca Ve + ve orta (-/+) hemaglutinasyon reaksiyonlar için gol olabilir. Bu yaklaşım, basit ve hızlı bir tekniği kullanılarak değerlendirilmiştir bir serum örnek reaktivite ve titresi sağlar. Video testin nasıl değiştirilebilir titre nasıl belirlenir sonuçlar okunur ve nasıl yorumlanır Testin ardındaki teori, ve bu tekniğin kullanımı ile ilişkili herhangi bir sorun kapsayacaktır.

Protocol

5x veronal Tamponlu Salin (VBS) hazırlanması

1. Veronal Tamponlu Salin (VBS) hazırlamak için, üç ayrı çözüm hazırlıklı olması gerekiyor.
2. Distile su 350ml Sodyum barbital NaCl ve 0.94gm 21.25gm çözme çözüm 1 hazırlayın. NaCl ve Sodyum barbital son konsantrasyonları sırasıyla 1.02m ve 13mm.
3. Sıcak distile su 125ml barbital, 1.44gm eriterek çözüm 2 hazırlayın. Barbital son konsantrasyon 62.5mm.
4. Distile su 100 ml CaCl ₂ MgCl ₂ ve 4.41gm 20.33gm eriterek çözüm 3 hazırlayın. MgCl ₂ ve CaCl ₂ final konsantrasyon sırasıyla 2,18 m ve 440mm.
5. Mix çözüm 1 ve 2 ve oda sıcaklığına kadar soğumasını.
6. Kombine çözüm soğuduktan sonra, 1.25 ml çözüm 3 ve pH 7,3-7,5 1M HCl kullanarak ayarlayabilirsiniz.
7. 5x bir stok solüsyonu hazırlamak için 500ml için son hacim distile su ile ayarlayın.
8. 1x çalışma çözeltisi hazırlamak için, saf su ile seyreltilmiş hisse 01:05.

Revercells, seyreltilmesi

1. Yavaşça tersine çevirerek Revercells stok solüsyonu tekrar süspansiyon haline getirin ve sonra 4 600g az 5 dakika boyunca santrifüj hücre ve 1ml kaldırmak ° C
2. Santrifüj sonra dikkatle süpernatant kaldırmak ve veronal Tuzlu Tamponlu 1x 3ml hücrelerin tekrar süspansiyon haline getirin.
3. Hücreler 4 ° C kullanana kadar saklanabilir.

Prosedür

1. 50ml 1x VBS 96 U alt plakası satır A1-A12 içine aktarın.
2. Eh, A1, anti-serum, 50μl ekleyin ve bir pipet kullanarak iyice karıştırın.
3. Taze bir pipet kullanarak, A1 kuyusunda sıvı 50μl kaldırmak ve iyi A2 transfer. İyice karıştırın ve iyi A11 ulaşmak ve daha sonra bu kuyudan son 50μl atmak kadar bu işlemi tekrarlayın.
4. Şimdi serum örneği seri 01:02 dan 1:2048 2 kat sulandırılmış oldu. Bu VBS negatif kontrol olarak serum Peki A12 eklenir.
5. Eğer birden fazla serum örneği değerlendirilecek, tekrar satır B vb 4,1-4,4 adımları
6. Bir kez tüm dilüsyonları yapılmış, tüm kuyulara 1% Revercells 50μl ekleyin. Not: Revercells zaman içinde çözecek ve kuyuların içine yavaşça reçete edilmeden önce ara verilmelidir.
7. Mikrotitre tepsinin yan hafifçe dokunarak örnekleri karıştırın, kapak ve 37 1s için devam etmek hemaglutinasyon reaksiyonu ° C bırakın Bir inkübatör veya uygun ısıtılmış bir oda kullanılabilir.
8. Inkübasyon sonrasında, dikkatli bir şekilde inkübatör tepsiyi kaldırın ve hemaglutinasyon plaka inceleyin. VBS kontrolü de iyi incelendiğinde ilk olmalıdır. Reaksiyonun negatif ise, daha sonra sonuçları geçerlidir. VBS örnek olumlu bir hemaglutinasyonun sonuç gösteriyorsa, o zaman sonuç ve süreç tekrar edilmelidir. Olumsuz bir tepki kuyunun merkezinde küçük bir hücre konsantre pelet olarak görünecektir olumlu bir hemaglutinasyon reaksiyonu, iyi tabanı geniş bir sayfa olarak görünecektir. Bir ara sonuç pelet hücrelerinin merkezi bir çekirdek ile pozitif hücrelerin bir hale olacaktır. Bu sonuç, serum tepki verebilir bazı Ab olarak oluşur, ancak tam bir reaksiyona neden yetersiz miktarda Ab.
9. Temsilcisi sonuç bölümünde iki şematik gösterimleri beklenen sonuçlar vardır. Sonuçların geçerli ve geçersiz bir set bir örnek verilir. Aynı zamanda anti-serum titresi tespit edilecektir.

Temsilcisi Sonuçlar:

Video temsilcisi sonuçlar bir örnek içerir. Aşağıda şematik bir biçimde gösterildiği gibi iki örnek k (fiekil 1 ve Şekil 2). İlk örnek, VBS kontrolü pozitif olarak yorumlanır olamaz bir reaksiyon ikinci belirlenecek titresi sağlar geçerli bir testtir.

Şekil 1 hemaglutinasyonun bir örnek pozitif sonuç başarısız oldu. Yukarıdaki şematik temsili, heamagglutination tepki kabul edilemez. VBS serum negatif kontrol kuyunun dibinde tabaka oluşumu ile kanıtlandığı gibi olumlu bir hemaglutinasyon reaksiyonu gösterir. Bu bir hata oluştu ve sonuç kabul edilemez olduğunu gösterir. Bu durumda, işlem tekrarlanmalıdır.

Şekil 2 pozitif sonuç doğru çalıştı hemaglutinasyonun bir örnek. Şematik temsili, heamagglutination reaksiyon geçerlidir. VBS negatif kontrol olumsuz hemaglutinasyon reaksiyonu gösterir.kuyunun dibinde oluşan pelet ile kanıtlanır. Son olumlu yanı, bu serum örneği için titresi 128 (yani karşılıklı 1 / 128) olduğunu gösterir satır 7,. Bu, orta miktarda serum bulunan bir antikor bir örnek olacaktır.

Discussion

Hemaglutinasyon testi zaman kısa bir süre içinde değerlendirilmesi gereken çok sayıda serum örneklerinin sağlayan çok basit bir teknik. Uygun olması göz, özel ekipman ihtiyacı olmadan okumak olmanın avantajı da vardır. Bu teknik de bir hemaglutinasyon-inhibisyon testi parçası olarak, idrarda insan koryonik gonadotropin hormonu tespiti için değiştirilmiş olabilir. Standart bir hemaglutinasyon testi ile ilgili olarak, bakım doğru yapılacak tahlil için alınması gereken birkaç alanları vardır. Birincisi, bu teknik, içbükey bir yüzeye hücrelerin yerleşmesinden dayanır. Bunun gibi, U ya da yuvarlak bir alt mikrotitre plaka esastır. Negatif ve pozitif reaksiyonlar özdeş olarak görünecektir genellikle ELISA gibi düz bir alt plaka kullanımı uygun değildir. Aynı zamanda farklı serum örnekleri kullanıldığında, reaktif antikorlar, farklı konsantrasyonlarda bulunması muhtemel olduğunu takdir edilmelidir. Yüksek antikor konsantrasyonu, antijen (Revercells) sınırlayıcı olabilir ve bir prozon etkisi görülebilir. Ancak bu olumlu bir reaksiyon son görüldüğü son kuyu olarak belirlenir, bu titre değerinin belirlenmesi etkilemez olmaz. Son olarak, bu tekniğin kantitatif değildir, serum reaktif antikor mutlak seviye olarak bilinmemektedir. Ancak, çoğu durumda bu bilinen bir antijen reaktivite belirlenmesi, gerekli tüm bilgileri, özellikle de gerekli değildir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Revercells	CSL	02490201	Use at 1% final
Anti-A serum	CSL	02611305
96 well U bottom plate	TRP	92097	Must be U-bottom
Veronal buffered saline			Use at 1x final
37°C room/incubator
Disposable gloves