一个微流体装置量化细菌趋稳定的浓度梯度

Summary

本协议描述了一个微流体装置的发展，为细菌的趋化调查chemoeffectors稳定的浓度梯度。

Abstract

趋使细菌方法诱食化学品的来源，或避免驱蚊化学品的来源。细菌不断地监视当前浓度的浓度进行比较具体chemoeffectors的浓度检测早几秒钟。这种比较，决定运动的净方向。虽然多个，竞争梯度往往共存于大自然，调查细菌的趋化作用的常规方法是最理想量化引诱剂和驱虫的浓度梯度迁移。在这里，我们描述了一个微流体的趋化模型，提出chemoeffectors精确和稳定的浓度梯度细菌和定量调查应用梯度的响应的发展。该装置是在任何所需的绝对浓度和梯度强度，浓度梯度的多功能，可以很容易扩散混合产生。该设备是证明使用的响应

Protocol

1。制备硅的主人，使用标准的SU - ⁸光刻1（在这个视频没有显示）。

1. 使用标准的SU - 8光刻方法，编造包含微流体网络和趋化室的PDMS模具的苏- 8“主”（SU - 8 2025年，MicroChem，牛顿，MA）的创建。这种掌握模具，可以制作任何微细加工设施（例如，斯坦福大学的微流体铸造; http://thebigone.stanford.edu/foundry/） ​​。
2. 的PDMS复制之前，公开的SU - 8的主蒸汽fluorosilane在连接到真空源，以方便从主PDMS容易释放干燥器中添加fluorosilane下降到纸巾，并申请一分钟的真空。拆下真空，并允许30分钟fluorosilane沉积。存放在密闭容器中以备将来使用SU - 8的主。

2。翻版硅橡胶成型，从SU - 8主：流体层和控制层是由硅橡胶成型的SU - 8主副本。

1. 10:1 WT混合的PDMS预聚物和交联剂。比和德加为1小时（或直到气泡从PDMS的混合物中删除）dessicator。
2. 放置在培养皿SU - 8的掌握和仔细的SU - 8的掌握上的PDMS混合物倒到所需的厚度。
3. 热的培养皿中含有的PDMS和在80的SU - 8母模° C至两小时治愈的PDMS。
4. 取出固化硅橡胶覆盖从烤盘SU - 8的掌握和剥离的PDMS模具从SU - 8主。所需的结构将被嵌入在PDMS模具。
5. 管梯度发生器和细胞的入口，使用20号钝针头的PDMS模具打孔。

3。 PDMS的设备的粘接：

1. 清洁玻璃显微镜玻片与异丙醇和干燥的氮气或空气流。
2. 公开的PDMS和载玻片氧等离子体在等离子体ASHER。
3. 带入接触载玻片的PDMS模具。联系幻灯片和PDMS模具加热至65 ° C，持续15分钟。

4。组装的PDMS设备

1. 使用刀片，切管在45 °角设备所需的正确的长度。
2. 管子的一端插入到设备使用镊子（例如，插座）砸出的洞。
3. 使用产钳，油管的另一端插入一个生硬的30号针头。
4. 所有剩余的孔，重复步骤4.2。
5. 在3ml的注射器收集的趋化缓冲液（CB）1ML，照顾，从注射器中删除的气泡。
6. 插座管的一端固定一针枢纽。
7. CB针枢纽，挖掘针枢纽，以消除任何气泡。
8. 推注射器的尖端的小CB出来，没有诱捕空气连接3ml的注射器针头枢纽。
9. 推动通过设备CB与CB填充，直到所有剩余的针枢纽。这应该删除的大部分气泡。
10. 填写两个500μL注射器与CB包含chemoeffector正在测试适当的浓度。消除气泡的形成，推动注射器内容的一个小水滴接触的液体滴在针枢纽和附加。
11. 同样，连接注射器，含CB细菌入口。当细菌进入设备，这将被删除。

5。高运动型大肠杆菌的生长大肠杆菌

1. 种植过夜培养的大肠杆菌大肠杆菌 RP437与绿色荧光蛋白表达质粒在20毫升蛋白胨肉汤（TB）在32 ° C，用颤抖的。添加适当的抗生素浓度以维持质粒。在我们的协议中，我们使用一个基于荧光设备的细菌检测低拷贝的质粒pCM182。为E.大肠杆菌日益增长的文化，在32 ° C，这样高蠕动，蠕动在较高的温度低。
2. 过夜培养，接种在250 mL锥形瓶中，在600nm处的光密度为0.05〜20 mL培养的结核病。文化成长与晃动在32 ° C。
3. 收获低速离心5分钟XG 400外径₆₀₀的0.45〜0.35的细胞。
4. 〜0.35 OD在CB ₆₀₀预计在通道中间的浓度含的chemoeffector重悬细胞。
5. RFP标记的死细胞，活细胞表达GFP的加一个外径_{600〜0.35。}死细胞（红色）被用来作为内部控制，以确保任何迁移是不是由于流动效应。

6。监测的趋化作用

1. 取出的细胞进针的CB枢纽。笔芯与细胞悬液。
2. 轻轻地填写与悬浮细胞50μL注射器。这一步需要做，慢慢鞭毛可以剪切，并会减少蠕动。
3. 将50μL注射器步骤4.10所述的进气针枢纽。
4. 设备上配有一个高速摄像机进行图像采集，在荧光显微镜阶段的位置。放入注射泵的进气口注射器（无论是500μL，梯度注射器和50μL细胞注射器），并启动梯度形成和细胞通过油管流向流量等。
5. 一旦细胞进入趋化室，等待系统〜20分钟前成像稳定。
6. 收集沿腔的长度不同的位置（对应不同的曝光时间），绿色（居住）和红色荧光图像（死）。通常情况下，我们在每个位置3秒的间隔收集的100幅图像。

7。数据分析：使用市面上任何图像分析程序（例如，ImageJ，Metamorph）或使用在Matlab编写的简单代码，可以执行下列步骤。

1. 删除背景像素的图像（即设定的阈值的像素强度，并删除所有具有强度低于阈值的像素）。这在降低噪声的分析。
2. 使用的死细胞（红色荧光）的位置，以确定图像的中心。由于死细胞没有趋化，这代表细胞进入趋化室，将在没有任何迁移检测的位置。
3. 找到图像中的活细胞（绿色荧光）。
4. 分成渠道的形象，并确定每个通道中的活细胞的数量。在我们以前的工作，1050μm宽的趋化室被分为64个通道，每个〜16微米宽。
5. 重复步骤7.1 7.3的所有图像，所有图像的每个通道的总细胞计数相加。这使得在实验期间的每个通道检测细胞总数。
6. 计算的趋化分配系数（中共），它代表的迁移方向，如下：在高浓度（右）和低浓度（左）双方的死细胞位于每个单元分配一​​个倍数+1和-1分别。也就是说，一个细胞迁移渐变乘以1，而细胞向下移动渐变乘以-1。所有乘以值加起来和标准化检测细胞的总数。例如，中国共产党的价值为0.40表明，细菌总数增加了40％，比低浓度一侧（即chemoeffector是诱食，为更多的细菌检测移动渐变）高浓度侧。
7. 计算的趋化迁移系数（CMC），重量细胞迁移距​​离的旅行，如下：重量细胞的每个通道中的一个因素，是细胞迁移的距离成正比的计数。一个细胞移动到最远的高浓度的位置（64通道）是一个加权系数+1，而移动一半浓度较高侧给出了0.5的加权系数，并移动到最远的一个细胞低浓度的立场是加权-1。总结所有的加权细胞计数和正常化的细胞数量产生管委会。

代表性的结果^3,4：

我们已经使用了微流体装置（ 图1A）这里描述的调查大肠杆菌趋化大肠杆菌的引诱（天门冬氨酸，autoinducer - 2）和驱虫（NISO _4，吲哚^）3,4梯度。典型的趋化应变⁵ E.大肠杆菌 RP437表达GFP一起使用，与卡那霉素死亡E.大肠杆菌 TG1中表达红色荧光蛋白监测流动效应。在μFlow设备中形成浓度梯度， 如图1b所示。所以，有没有通过它的流量和一个稳定的梯度0 100毫微克/毫升fluoresscein，在设备，单元入口加盖。器件上的像素点的亮度来确定的荧光素浓度剖面。数据显示，细菌遇到的线性渐变，当他们进入趋化室。图2A和 B 显示 E.荧光图像大肠杆菌 RP437天门冬氨酸（0 100微米）和NISO _4（0 225微米）的梯度迁移。所观察到的反应，这些规范的诱食和驱蚊预测图3A显示E.量化分配大肠杆菌 RP437 在浓度梯度的情况下（即，空，天门冬氨酸的梯度），而图3B和C，天门冬氨酸和_NISO 4梯度分布。这些反应的特异性（即，在移民的偏见）是显而易见的，作为一个E。 大肠杆菌 RP437Δ 焦油应变（即应变缺乏在大肠杆菌中的焦油化学感受器是感天门冬氨酸和镍），并不能说明在迁移中存在的天门冬氨酸或NISO ₄的浓度梯度的偏见。在空间的分布状况的明显趋势，也与计算的中国共产党和中央军委值一致。 E 的迁移，中国共产党重视大肠杆菌 RP437在₄天门冬氨酸或NISO的梯度，分别为0.33和-0.33。相应的CMC值分别为0.13和-0.14。相比之下，中国共产党和CMC值的大肠杆菌大肠杆菌 RP437Δ 焦油的天门冬氨酸或NISO ₄的应变梯度可以忽略不计。此外，中共中央和中央军委的天门冬氨酸的空梯度，分别为0.03和0.02，并注明缺乏迁移的偏差，在渐变的情况下。

图1。设备原理图和浓度梯度 。
（一）微流体的趋化设备的示意图。该装置由一个渐变混合模块（20 × 100 × 18750微米）和趋化观察模块（20 × 1050 x 11500微米）。梯度进入设备的两个渠道的宽度是500微米，细菌入口的宽度为50μm。插图描绘了一个渐变的信号分子（灰色）和细菌在它迁移。活的细菌被描述为实心椭圆形，而死亡的细菌是开放式的椭圆形所示。 （B）在0和100纳克/毫升荧光之间的浓度梯度生成设备和成像用荧光显微镜。被收购后的30分钟的荧光图像和图像分析量化。

图2。趋化E。大肠杆菌 RP437在微流体装置。
大肠杆菌 RP437暴露的梯度（一）0-100微米L -天门冬或（B）0-225微米NISO ₄设备和活的细菌迁移（绿色）对L -天门冬或远离镍成像为30分钟，每2.5秒。死菌（红色）担任控制设备中的流动效应。使用一个内部开发的分析program3的图像进行了量化。数据显示，有代表性的3次独立实验的伪彩色图像。

图3：迁移型材量化到一个规范的引诱剂和驱虫剂。
在微流体装置的空间分布RP437在回应（一）统一的100微米L -天门冬（即无梯度），（二）0 100天门冬氨酸微米梯度，和（C）0 225 _NISO 4微米梯度。 RP437细胞的分布是死细胞的分布是实线所示，虚线所示， 和 ^RP437 EDA +Δ焦油细胞的分布是一条虚线所示。数据显示，平均为3次独立实验。

Discussion

在毛泽东等人 ⁵所描述的趋化分配系数（CPC）和趋化迁移系数（CMC），可以计算出。如果一个细胞上检测到高浓度侧，它是一个价值1，而在低浓度侧检测的单元格值-1。值总结和细胞总数除以产生中国共产党。中国共产党的符号（正或负）给出的迁移方向（朝向或远离信号）。虽然中国共产党表示是否细胞作为一种化学引诱或驱蚊剂，它没有量化的趋化程度。对于这一点，我们除以整个设备的宽度为64节（32细胞的进气口两侧）细菌的空间分布情况，并在每节分配加权因子对细胞的基础上的距离计算管委会迁移。从中心（第1和64）最远的部分乘以1（= 31.5/31.5）或-1，因为它们包含有细胞迁移的最大距离。接下来的两节（2和63）乘以0.968（= 30.5/31.5）-0.968。最后两节（即32和33是最接近的细胞入口）乘以0.015（= 0.5/31.5）或-0.015。总结和规范化的细胞总数生成CMC的加权值。一个1中央军委指示，所有的细菌向上移动渐变完全流室的墙上。在一个温和的吸引力反应情况下，管委会将仍然是一个积极的，但有一个较小的值，而中共的价值仍然是1。因此，中央军委歧视的基础上，迁移程度的响应细胞。

某些参数需要仔细控制，而趋化实验。细菌培养的温度是很重要的。为E.大肠杆菌 ，我们所观察到的最佳生长温度为32℃和较高的温度降低蠕动。对于某些受体细菌，它可能是必要的，成长中存在的诱导chemoeffector（即总理趋化细胞）细菌。例如，调查时细菌反应麦芽糖，细胞生长糖0.1％（W / V）。当resuspending离心后的细菌，它是重要的，轻轻摇动/轧管是细胞不振荡。剧烈摇晃，可以剪切鞭毛，减少细胞被测试的蠕动。蠕动的细菌被测试的基础上，在设备中使用流率将需要确定。流速较慢，可能需要对细菌，少运动型，和最佳的流速必须凭经验确定。

我们预计，可用于对细菌的趋化作用（例如，同一受体chemoeffectors之间的竞争），以及在确定响应引诱或驱虫剂的特定化学品的环境样品中的细菌的基本调查μFlow设备。