Микрожидкостных Устройство для Количественная Бактериальные Хемотаксис в стабильных градиента концентрации

Summary

Этот протокол описывает развитие микрожидкостных устройств для исследования бактериальной хемотаксис в стабильных градиенты концентраций chemoeffectors.

Abstract

Хемотаксис позволяет бактериям подход источников аттрактанта химических веществ, или чтобы избежать источников репеллент химикатов. Бактерии постоянно контролировать концентрацию конкретных chemoeffectors путем сравнения текущей концентрации к концентрации обнаружены несколько секунд раньше. Это сравнение определяет чистая направление движения. Хотя многочисленные, конкурирующие градиенты часто сосуществуют в природе, традиционные подходы для исследования бактериальной хемотаксис населения недостаточны для количественного миграции в ответ на градиентов концентрации аттрактанты и репелленты. Здесь мы описываем развитие микрожидкостных модель хемотаксиса для представления точных и стабильных градиентов концентрации chemoeffectors к бактериям и количественном исследовании их реакции на применяемые градиента. Устройство является универсальным в том, что концентрация градиенты любой желаемой абсолютной концентрации и градиент силы могут быть легко порожденных диффузионного перемешивания. Устройство продемонстрировать с помощью реакции

Protocol

1. Производство кремния мастеров с использованием стандартных SU-8 фотолитографии ¹ (не показано в этом видео).

1. Используйте стандартные SU-8 методами фотолитографии для создания СУ-8 "мастер" (SU-8 2025 года, MicroChem, Ньютон, штат Массачусетс) для изготовления пресс-формы PDMS, который содержит микрожидкостных сети и хемотаксис камеры. Такие формы мастера могут быть изготовлены в любой микротехнологий объекта (например, Стэнфордский Microfluidics Литейный; http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
2. До репликации PDMS, подвергать SU-8 мастер fluorosilane пара в сушильном шкафу придает источником вакуума для облегчения выпуска PDMS от хозяина. Добавить каплю fluorosilane к бумажным полотенцем и применять вакуумные для одного мин. Снимите вакуумный и позволить 30 мин для осаждения fluorosilane. Держите SU-8 мастер в закрытом контейнере для использования в будущем.

2. Реплика формования PDMS от SU-8 мастер: жидкостный слой и слой управления, сделаны реплики формования PDMS от SU-8 хозяина.

1. Смешайте PDMS предварительно полимера и сшивающего агента в 10:01 мас. соотношение и дегазации в эксикаторе в течение 1 часа (или пока пузырьки воздуха удаляют из смеси PDMS).
2. Место SU-8 мастером в чашке Петри и осторожно вылейте смесь PDMS поверх SU-8 мастера до требуемой толщины.
3. Тепло чашке Петри содержащие PDMS и SU-8 мастер формы при 80 ° С в течение двух часов, чтобы вылечить PDMS.
4. Удалить вылечить PDMS покрытые SU-8 мастера из плиты и очистить плесень PDMS от SU-8 хозяина. Желаемую структуру будет встраиваться в форме PDMS.
5. Удар отверстия в форме PDMS для труб с генератором градиент и клеточной входе использованием 20 калибра тупой конец иглы.

3. Склеивание PDMS устройств:

1. Чистая предметное стекло микроскопа с изопропанола и сухой азот или воздушным потоком.
2. Expose PDMS и стекло для кислородной плазмы в плазме Ашер.
3. Принесите плесень PDMS в контакт с стекло. Тепло связался с горкой и PDMS плесень до 65 ° С в течение 15 мин.

4. Сборка устройства PDMS

1. Использование лезвие бритвы, разрезать трубы на угол 45 ° для правильной длины, необходимых для устройства.
2. Вставьте один конец трубки в отверстия, пробитые в устройстве (например, розетки) с помощью щипцов.
3. Использование щипцов, вставьте тупой 30-иглы на другом конце трубки.
4. Повторите шаг 4,2 для всех остальных отверстий.
5. Сбор 1 мл хемотаксиса буфера (ЦБ) в 3 мл шприц, следя за тем, чтобы удалить пузырьки воздуха из шприца.
6. Fix иглы хаб к одному концу розетки трубы.
7. Добавить ЦБ иглы концентратор, и нажмите иглы хаб для удаления пузырьков воздуха.
8. Нажмите немного из ЦБ кончике шприца и подключить 3 мл шприца с иглой хаб без захвата воздуха.
9. Нажмите ЦБ через устройство, пока все остальные центры иглы заполнены с ЦБ. Это должно устранить большинство пузырьков воздуха.
10. Заполните два 500 мкл шприцы с ЦБ, содержащий соответствующие концентрации chemoeffector проходит испытания. Ликвидация образование воздушных пузырьков, нажав из маленькой капли содержимое шприца и трогательно снизится до жидкости в иглу ступицы и крепления.
11. Точно так же подключить шприц, содержащий ЦБ входе бактерий. Это будет удалена, когда бактерии внедряются в устройство.

5. Рост очень подвижны Е. палочки

1. Расти ночь культур E. кишечной RP437 с выражением GFP плазмиды в 20 мл бульона триптон (ТБ) при 32 ° C при встряхивании. Добавить соответствующей концентрации антибиотиков для поддержания плазмид. В нашем протокол, мы используем низким копии плазмиды pCM182 для обнаружения бактерий на основе флуоресценции в устройстве. Для E. палочки, растущие культуры на 32 ° C рекомендуется для высокой подвижности, а подвижность ниже при более высоких температурах.
2. Используйте ночной культуры привить 20 мл культуры туберкулеза в 250 мл колбу Эрленмейера на оптическую плотность при 600 нм от ~ 0,05. Рост культуры при встряхивании при 32 ° C.
3. Урожай клеток на OD ₆₀₀ из ~ 0,35 0,45 с низкой скоростью и центрифугирования при 400 мкг в течение 5 мин.
4. Ресуспендируют клетки OD ₆₀₀ из ~ 0,35 в ЦБ содержащие chemoeffector при концентрации ожидается в середине канала.
5. Добавить RFP меченных мертвые клетки на OD ₆₀₀ из ~ 0,35 до GFP-экспрессирующих живых клеток. Мертвый (красный) клетки используют в качестве внутреннего контроля для обеспечения того, чтобы любая миграция не из-за потока эффектов.

6. Мониторинг хемотаксис

1. Удалите некоторые из ЦБ с иглы входе ячейкихаб. Пополнение с клеточной суспензии.
2. Аккуратно заполните шприц 50 мкл ресуспендировали клеток. Этот шаг необходимо сделать, медленно, как жгутики могут быть стриженой и снизит подвижность.
3. Прикрепите шприц 50 мкл приточно-игла хаб как описано в шагах шагом 4.10.
4. Расположите устройство на этапе флуоресцентный микроскоп оснащен высокоскоростной камеры для получения изображений. Место входа шприцов (как 500 мкл шприцы градиента и 50 мкл шприц ячейки) в шприц насос и инициировать поток такой, что градиент формируется и клетки, протекающего через трубку.
5. Как только клетки вступают камеры хемотаксис, ждать ~ 20 мин, чтобы система стабилизации изображения, прежде чем.
6. Сбор зеленой (живой) и красный (умерших) флуоресцентные изображения в различных местах по всей длине камеры (соответствует разное время экспозиции). Как правило, мы собираем 100 изображений в каждом месте на 3 интервала сек.

7. Анализ данных: Следующие шаги могут быть выполнены с использованием любых имеющихся в продаже программ для анализа изображений (например, ImageJ, Метаморф) или используя простые коды записаны в Matlab.

1. Удалить фон пикселей в изображении (то есть, установить порог интенсивности пикселей и удалить все пиксели, которые имеют интенсивность меньше, чем порог). Это сводит к минимуму шум в анализе.
2. Используйте положение мертвых клеток (красной флуоресценции), чтобы определить центр изображения. Поскольку мертвые клетки не проявляют хемотаксис, это представляет позицию, где клетки вступают хемотаксис камере и был бы обнаружен в отсутствие каких-либо миграции.
3. Найдите живых клеток (зеленая флуоресценция) в изображении.
4. Разделите изображение на каналы и определяют количество живых клеток в каждом канале. В нашей предыдущей работе ^3, 1050 мкм, хемотаксис камере был разделен на 64 каналов, каждый из которых ~ 16 мкм в ширину.
5. Повторите шаги 7,1 7,3 для всех изображений и сумма общего подсчитывает ячейки для каждого канала на всех изображениях. Это дает общее число клеток обнаружены на каждом канале в течение срока эксперимента.
6. Рассчитать коэффициент хемотаксис раздела (КТК), который представляет направление миграции, а именно: Каждая ячейка находится в высокой концентрации (справа) и низкой концентрации (слева) стороны мертвых клеток присваивается множитель +1 и -1 , соответственно. То есть, клетка, которое перемещается вверх градиент умножается на +1 тогда как клетки, движется вниз градиентом умножаются на -1. Все умноженные значения суммируются и нормированная на общее количество обнаруженных клеток. Например, значение цены за клик составляет 0,40 показывает, что на 40% больше от общего бактерий переехал в сторону высоких концентрациях, чем на стороне низкого концентрации (то есть, chemoeffector является аттрактанта как больше бактерий было обнаружено движение вверх градиента).
7. Рассчитать коэффициент хемотаксис миграции (CMC), которая весит миграции клеток пройденное расстояние, а именно: Вес клеток в каждом канале, на коэффициент, пропорциональный расстоянию, что клетки мигрировать. Ячейку, перемещается в дальний высокой концентрации позиции (канал 64) дается весовой коэффициент +1, в то время как один, что движется на полпути в более высокой концентрации стороне дается весовой коэффициент 0,5, а ячейка переходе на дальний низкой концентрации взвешенной позиции на -1. Суммируем все взвешенные-клеток и нормализации на количество клеток для получения СМС.

Представитель Результаты ^3,4:

Мы использовали микрожидкостных устройств (рис. 1А), описанный здесь, чтобы исследовать хемотаксис Е. палочки в градиентах аттрактантов (аспарагиновой кислоты, аутоиндуктор-2) и репелленты (NiSO _4, индол) ^3,4. Прототипом штамм хемотаксис ⁵ Е. кишечной RP437 выражения GFP был использован, наряду с канамицином-убил Е. кишечной TG1 клеток, экспрессирующих красный флуоресцентный белок для контроля потока эффектов. Градиента концентрации образуются в μFlow устройство показано на рисунке 1b. Клетка входе был ограничен, так что не было никакого потока через него и стабильный градиент 0 100 нг / мл fluoresscein была создана в устройства. Интенсивности пикселей через устройства был использован для определения профиля концентрации флуоресцеина. Данные показывают, что бактерии встреча линейный градиент, когда они входят камеры хемотаксиса. 2A рис и В показывает, флуоресцентные изображения Е. кишечной RP437 миграции в ответ на градиенты аспарагиновой кислоты (0 100 мкМ) и NiSO ₄ (0 225 мкМ). Наблюдается ответы на эти канонические аттрактанта и репеллента которые, как предсказано. Рис 3A показывает количественное распределение Е. кишечной RP437 при отсутствии градиента концентрации (то есть, нулевой градиент аспарагиновой кислоты), аЦифры 3B и C показывают распределение по градиентам аспарагиновой кислоты и NiSO _4. Специфика этих ответов (например, смещение в миграции) видно, как E. кишечной RP437 Δ смолы штамм (т.е. штамм не хватает Тар хеморецепторов, которая используется в E.coli в смысле аспарагиновой кислоты и никеля) не демонстрируют предвзятость в миграции при наличии градиента концентрации аспарагиновой кислоты или NiSO _4. Тенденции очевидны в пространственных профилей распределения также согласуются с расчетными КПК и CMC ценностей. КПК значения для миграции Е. кишечной RP437 в градиентах аспарагиновой кислоты или NiSO _4, 0,33 и -0,33 соответственно. Соответствующие значения КМЦ 0,13 и -0,14 соответственно. В отличие от КПК и CMC значений с E. кишечной RP437 Δ смолы напряжение в градиентов аспарагиновой кислоты или NiSO ₄ пренебрежимо малы. Кроме того, КПК и КМЦ в нуль градиент аспарагиновой кислоты 0,03 и 0,02, соответственно, и указывают на отсутствие предвзятости в миграции в отсутствие градиента.

Рисунок 1. Схема устройства и градиента концентрации.
(А) Схематическое изображение микрожидкостных устройств хемотаксис. Устройство состоит из градиент смешивания модуль (20 х 100 х 18 750 мкм) и модуль хемотаксис наблюдения (20 х 1050 х 11500 мкм). Шириной два градиент каналы ввода устройства 500 мкм и шириной входе бактерий составляет 50 мкм. На вставке изображена градиент сигнальная молекула (серый) и бактерий, мигрирующих в связи с ним. Живые бактерии изображены в виде твердых овалов, в то время как мертвые бактерии показаны как открытые овалов. (B), градиент концентрации от 0 до 100 нг / мл флуоресцеина было создано в устройстве и отображение с помощью флуоресцентной микроскопии. Флуоресцентные изображения были приобретены через 30 мин и количественно анализа изображений.

Рисунок 2. Хемотаксис Е. кишечной RP437 в микрожидкостных устройств.
Кишечная палочка RP437 подвергался градиент () 0-100 мкМ L-аспартата или (В) 0-225 мкМ NiSO ₄ в устройстве и миграции живых бактерий (зеленый цвет) по отношению к L-аспартата или от никель отображаемого каждые 2,5 секунды в течение 30 мин. Мертвых бактерий (красный) служила контролем расхода эффекты в устройстве. Изображения были количественно с использованием собственной разработки анализа program3. Данные указаны представитель псевдо-цветные изображения из трех независимых экспериментах.

Рисунок 3: Количественное миграции профилей для канонического аттрактанта и отталкивающим.
Пространственное распределение RP437 в микрожидкостных устройства в ответ на () равномерное 100 мкМ L-аспартата (т.е. не градиент), (B) 0 100 мкМ градиент аспартата, и (С) 0 225 мкМ градиент NiSO ₄ . Распределение мертвых клеток показано, как сплошная линия, распределение RP437 клетки показана в виде пунктирной линии, а также распределение RP437 EDA ⁺ Δ клетки смолы показан в виде пунктирной линии. Данные, приведенные усредняются для трех независимых экспериментов.

Discussion

Коэффициент хемотаксис раздела (КТК) и коэффициент хемотаксис миграции (CMC) может быть рассчитана, как описано в Мао и др. ^5. Если ячейка обнаружена высокая концентрация стороны, ему присваивается значение +1, тогда как клетка обнаружены на низкой стороне концентрация дается значение -1. Значения суммируются и делятся на общее количество клеток для создания КПК. Знак КПК (положительной или отрицательной), дает направление миграции (к или от сигнала). Хотя КПК указывает клетки реагируют на химические аттрактанта и неприятного, он не количественно степень хемотаксис. Для этого, мы рассчитываем CMC путем деления пространственный профиль распределения бактерий по всей ширине устройства на 64 разделов (32 с каждой стороны ячейки вход), и назначив весовой коэффициент для клеток в каждом разделе основаны на расстоянии миграцией. Разделы наиболее удаленных от центра (статьи 1 и 64), умножаются на +1 (= 31.5/31.5) или -1, так как они содержат клетки, которые мигрировали максимального расстояния. Следующие два раздела (2 и 63) умножить на 0,968 (= 30.5/31.5) или -0,968. Последние два раздела (то есть, 32 и 33, которые находятся ближе всего к ячейке вход) умножаются на + 0,015 (= 0.5/31.5), или -0,015. Взвешенные значения суммируются и нормированная на общее число ячеек для получения СМС. СМС +1 означает, что все бактерии переехал полностью зависит от градиента на стене проточную камеру. В случае мягкой привлекательным ответ СМС все равно будет положительным, но имеют меньшее значение, тогда как значение цены за клик все равно будет +1. Таким образом CMC дискриминацию реагировать элементов на основе степени миграции.

Некоторые параметры должны быть тщательно контролируется при выполнении хемотаксис экспериментов. Температура, при которой бактерии культивируют очень важно. Для E. палочка, мы заметили, что лучший рост температур 32 ° С и выше температура приводит к снижению подвижности. Для определенных рецепторов присутствуют в бактерии, это может быть необходимо расти бактерии в присутствии вызывающих chemoeffector (т. е. к премьер клеток для хемотаксис). Например, при исследовании реакции бактерий мальтоза, клетки выращивают с 0,1% (м / о) из сахара. Когда ресуспендированием бактерий после центрифугирования, важно, чтобы осторожном встряхивании / прокатки трубки выполняется, и клетки не перемешивают. Энергичного встряхивания можно сдвига жгутиков и уменьшить подвижность клетки проходит испытания. Расходов, используемых в устройстве должны быть определены на основе подвижности бактерий проходит испытания. Более медленные темпы потока могут потребоваться для бактерий, которые являются менее подвижным, и оптимальная скорость потока должна быть определена опытным путем.

Мы ожидаем, что μFlow устройство может использоваться для фундаментальных исследований на бактериальные хемотаксис (например, конкуренция между chemoeffectors за тот же рецептор), а также в выявлении бактерий в пробах окружающей среды, которые отвечают на особенности химических веществ в качестве аттрактантов или репеллентов.