Einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Quantifizierung von bakteriellen Chemotaxis in Stable Konzentrationsgradienten

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Untersuchung der bakteriellen Chemotaxis in stabilen Konzentrationsgradienten chemoeffectors.

Abstract

Chemotaxis ermöglicht Bakterien zu den Quellen der Lockstoff Chemikalien-Ansatz oder die Quellen der abweisenden Chemikalien zu vermeiden. Bakterien ständig die Konzentration von bestimmten chemoeffectors durch den Vergleich der aktuellen zur Konzentration detektiert ein paar Sekunden früher. Dieser Vergleich bestimmt, die Netto-Richtung der Bewegung. Obwohl mehrere, konkurrierende Verläufe oft in der Natur existieren, sind konventionelle Ansätze zur Untersuchung der bakteriellen Chemotaxis suboptimal für die Quantifizierung der Migration in Reaktion auf Konzentrationsgradienten von Lockstoffen und Repellents. Hier beschreiben wir die Entwicklung einer mikrofluidischen Chemotaxis-Modell für die Präsentation präzise und stabile Konzentrationsgradienten chemoeffectors Bakterien und quantitative Untersuchung ihrer Reaktion auf das angelegte Gefälle. Das Gerät ist vielseitig, dass Konzentrationsgradienten beliebiger absolute Konzentration und Gradientenstärke kann leicht durch diffusive Mischen erzeugt werden. Das Gerät wird demonstriert mit der Reaktion der

Protocol

1. Herstellung von Silizium-Master mithilfe von Standard-SU-8 Photolithographie ¹ (nicht in diesem Video gezeigt).

1. Verwenden Sie Standard-SU-8 Photolithographie Methoden, um eine SU-8 "Master" (SU-8 2025 MicroChem, Newton, MA) zur Herstellung der PDMS Form, dass die mikrofluidischen Netzwerk-und Chemotaxis Kammer enthält. Solche Master-Formen können jederzeit Mikrofabrikation Anlage (, z. B. Stanford Mikrofluidik Foundry hergestellt werden http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
2. Vor PDMS-Replikation, setzen die SU-8 Master Fluorsilan Dampf in einem Exsikkator an einem Vakuum-Quelle auf einfache Veröffentlichung von PDMS aus dem Master zu erleichtern. Einen Tropfen Fluorsilan auf ein Papiertuch und gelten Vakuum für eine min. Entfernen Sie das Vakuum und damit 30 min für die Abscheidung von Fluorsilan. Halten Sie die SU-8-Master in einem geschlossenen Behälter für die zukünftige Verwendung.

2. Replica Formen von PDMS von SU-8-Master: Die fluidische Schicht und die Kontrolle Schicht durch Replikat des PDMS von SU-8 Master gemacht.

1. Mix der PDMS-pre-Polymer und Vernetzer bei einem 10:1-wt. Verhältnis und Degas in einem Exsikkator für 1 Stunde (oder bis Luftblasen aus der PDMS-Mischung entfernt).
2. Legen Sie die SU-8 Master in einer Petrischale und vorsichtig gießen Sie die PDMS-Mischung auf der Oberseite des SU-8 Master auf die gewünschte Dicke.
3. Erhitzen Sie die Petrischale mit dem PDMS und der SU-8 Master-Form bei 80 ° C für zwei Stunden, um die PDMS zu heilen.
4. Entfernen Sie das gehärtete PDMS-bedeckten SU-8 Master von der Heizplatte und schälen die PDMS Form aus dem SU-8-Master. Die gewünschte Struktur wird in der PDMS-Form eingebettet sein.
5. Löcher in die PDMS Gussform für Schlauch mit dem Farbverlauf-Generator und Zell-Einlass mit einer 20-Gauge-blunt-end Nadel.

3. Kleben von PDMS-Geräte:

1. Reinigen Sie einen Glasobjektträger mit Isopropanol und mit Stickstoff trocken oder einen Luftstrom.
2. Setzen Sie die PDMS-Glas-Folie, um Sauerstoff-Plasma in einem Plasma Asher.
3. Bringen Sie die PDMS Form in Kontakt mit dem Objektträger aus Glas. Heizen Sie den Kontakt mit Rutsche und PDMS Form bis 65 ° C für 15 min.

4. Montage der PDMS-Gerät

1. Mit einer Rasierklinge geschnitten Rohres im 45 ° Winkel auf die richtige Länge für das Gerät erforderlich.
2. Stecken Sie ein Ende des Schlauches in die Löcher in das Gerät (zB Steckdose) mit einer Pinzette gestanzt.
3. Mit einer Pinzette, legen Sie eine stumpfe 30-Gauge-Nadel in das andere Ende des Schlauchs.
4. Wiederholen Sie Schritt 4.2 für alle übrigen Löcher.
5. Sammeln Sie 1 ml der Chemotaxis-Puffer (CB) in einer 3 ml Spritze, kümmert sich um Luftblasen aus der Spritze zu entfernen.
6. Fix eine Nadel-Hub an einem Ende der Ablaufschlauch.
7. Add CB, um die Nadel-Hub, und tippen Sie auf die Nadel-Hub, um mögliche Luftblasen zu entfernen.
8. Schieben Sie ein wenig CB aus der Spitze der Spritze und schließen Sie das 3 ml Spritze mit der Nadel-Hub ohne Lufteinschluss.
9. Push-CB durch das Gerät, bis alle verbleibenden Nadel-Hubs mit mit CB gefüllt sind. Dies sollte die Mehrheit der Luftblasen.
10. Füllen zwei 500μL Spritzen mit CB mit den entsprechenden Konzentrationen der chemoeffector getestet. Vermeiden Sie Luftblasenbildung, indem ein kleiner Tropfen der Spritze Inhalte und berühren Sie mit dem Tropfen der Flüssigkeit in die Nadel-Hub und Befestigung.
11. Ebenso verbinden eine Spritze mit CB, um die Bakterien Einlass. Diese werden entfernt, wenn Bakterien in das Gerät eingeführt werden.

5. Das Wachstum von hoch bewegliche E. coli

1. Wachsen Sie über Nacht Kulturen von E. coli RP437 mit einem GFP-Expressionsplasmid in 20 ml Trypton Bouillon (TB) bei 32 ° C unter Schütteln. Add geeigneten Konzentrationen von Antibiotika, um das Plasmid zu erhalten. In unserem Protokoll, verwenden wir ein low-copy Plasmid pCM182 zum Nachweis von Bakterien auf Fluoreszenz in dem Gerät auf. Für E. coli, wachsenden Kulturen bei 32 ° C ist für hohe Beweglichkeit zu empfehlen, da die Motilität ist niedriger bei höheren Temperaturen.
2. Verwenden Sie die Übernacht-Kultur zu einer 20 ml Kultur von TB in einem 250 ml Erlenmeyerkolben impfen zu einer optischen Dichte bei 600nm von ~ 0,05. Die Kultur unter Schütteln bei 32 ° C.
3. Ernten Sie die Zellen bei einer OD ₆₀₀ von ~ 0,35 0,45 langsame Zentrifugation bei 400 xg für 5 min.
4. Die Zellen auf eine OD ₆₀₀ von ~ 0,35 in CB mit der chemoeffector auf die Konzentration in der Mitte des Kanals zu erwarten.
5. Add RFP-markierten toten Zellen bei einer OD ₆₀₀ von ca. 0,35 bis die GFP-exprimierenden lebende Zellen. Die Toten (rot) Zellen sind als interne Kontrolle, um sicherzustellen, dass eine Migration nicht aufgrund Flow-Effekte verwendet.

6. Überwachung Chemotaxis

1. Entfernen Sie einige der CB aus der Zelle EinlassnadelHub. Refill mit der Zellsuspension.
2. Vorsichtig füllt die 50 ul Spritze mit der resuspendierten Zellen. Dieser Schritt muss langsam erfolgen, wie Geißeln können geschert werden und Beweglichkeit zu reduzieren.
3. Bringen Sie die 50 ul Spritze mit dem Einlass-Kanülenansatz wie in den Schritten Schritt 4.10 beschrieben.
4. Stellen Sie das Gerät auf der Bühne ein Fluoreszenzmikroskop mit einem High-Speed-Kamera für die Bildaufnahme ausgestattet. Legen Sie die Einlass-Spritzen (beide 500 mL Gradienten Spritzen und die 50 ul Zell-Spritze) in die Spritzenpumpe und initiieren fließen, so dass der Gradient gebildet wird und die Zellen werden durch den Schlauch fließt.
5. Sobald Zellen der Chemotaxis Kammer betreten, warten ca. 20 min, bis das System vor Bildgebung zu stabilisieren.
6. Sammeln grün (live) und rot (tot) Fluoreszenzbilder an verschiedenen Orten entlang der Länge der Kammer (entsprechend unterschiedlichen Belichtungszeiten). Normalerweise sammeln wir 100 Bilder an jedem Ort auf 3 Sekunden-Intervallen.

7. Datenanalyse: Die folgenden Schritte kann mit jedem handelsüblichen Bildanalyse-Programm (zB ImageJ, Metamorph) oder mit einfachen Codes in Matlab geschrieben werden.

1. Entfernen Sie den Hintergrund Pixel im Bild (dh eingestellte Schwelle Pixelintensität und entfernen Sie alle Pixel, die Intensität haben weniger als die Schwelle). Dies minimiert die Geräuschentwicklung in der Analyse.
2. Verwenden Sie die Position des toten Zellen (rote Fluoreszenz), um die Mitte des Bildes zu bestimmen. Da die toten Zellen keine Chemotaxis zeigen, ist dies die Stelle, an Zellen in die Chemotaxis Kammer und würde in Ermangelung einer Migration erkannt werden.
3. Suchen lebenden Zellen (grüne Fluoreszenz) in das Bild.
4. Unterteilen Sie das Bild in die Kanäle und die Anzahl der lebenden Zellen in jedem Kanal. In unserer vorherigen Arbeit ^3, wurde der 1050 um breit Chemotaxis Kammer in 64 Kanäle, die jeweils ~ 16 &mgr; m breit sind geteilt.
5. Wiederholen Sie die Schritte 7,1 7,3 für alle Bilder und die Summe der gesamten Zellzahl pro Kanal auf allen Bildern. Dies gibt der gesamten Zellzahl bei jeder Kanal über die Dauer des Experiments erkannt.
6. Berechnen Sie die Chemotaxis Verteilungskoeffizient (CPC), die die Richtung der Migration darstellt, wie folgt: Jede Zelle in der hohen Konzentration (rechts) und geringer Konzentration (links) Seiten des toten Zellen befindet, ist ein Multiplikator von +1 und -1 zugeordnet bzw.. Das heißt, eine Zelle, die bis wandert eine Steigung von +1 multipliziert wird, während Zellen bewegten sich die Steigung von -1 multipliziert werden. Alle multiplizierten Werte werden addiert und normiert auf die Gesamtzahl der gefundenen Zellen. Zum Beispiel zeigt eine CPC-Wert von 0,40, dass 40% mehr des gesamten Bakterien, die hohe Konzentration Seite geschoben, als die geringe Konzentration Seite (dh der chemoeffector ist ein Lockstoff als mehr Bakterien nachgewiesen wurden bewegt sich die Steigung).
7. Berechnen Sie die Chemotaxis Migration Koeffizient (CMC), die die Migration von Zellen durch die zurückgelegte Strecke, wie folgt wiegt: Gewicht der Zellzahl in jedem Kanal durch einen Faktor, der proportional zum Abstand, dass die Zellen wandern wird. Eine Zelle, die bis in die entferntesten mit hoher Konzentration Position (Kanal 64) bewegt, ist ein Gewichtungsfaktor von +1 gegeben, während eine, die auf halbem Weg bewegt sich in der höheren Konzentration Seite ein Gewichtungsfaktor von +0,5 gegeben wird, und eine Zelle bewegen, die am weitesten low-Konzentration Position ist mit -1 gewichtet. Fassen Sie alle gewichteten Zellzahlen und normalisieren, um die Anzahl der Zellen, die CMC zu generieren.

Repräsentative Ergebnisse ^3,4:

Wir haben das Mikrofluidikvorrichtung (Abbildung 1A) beschrieben hier, um Chemotaxis von E. untersuchen coli in Gradienten von Lockstoffen (Asparaginsäure, Autoinducer-2) und Repellentien (NiSO _4, Indol) ^3,4. Die prototypische Chemotaxis Belastung ⁵ E. coli RP437, die GFP verwendet wurde, zusammen mit Kanamycin-getötet E. coli TG1-Zellen, die rot fluoreszierendes Protein zu fließen Auswirkungen überwacht. Der Konzentrationsgradient in der μFlow Vorrichtung ausgebildet ist in Abbildung 1B gezeigt. Die Zelle Einlass wurde verschlossen, so dass es keine durchströmt und einen stabilen Verlauf der 0 100 ng / mL fluoresscein im Gerät eingerichtet wurde. Die Pixel-Intensität in das Gerät eingesetzt wurde, um die Konzentration Profil von Fluorescein zu bestimmen. Die Daten zeigen, dass Bakterien einen linearen Verlauf begegnen, wenn sie die Chemotaxis Kammer betreten. 2A und B zeigt Fluoreszenzbilder von E. coli RP437 Migration in Reaktion auf Gradienten von Asparaginsäure (0 100 uM) und NiSO ₄ (0 225 uM). Die beobachteten Reaktionen auf diese kanonischen Lockstoff und abweisend sind wie vorhergesagt. 3A zeigt die quantifizierte Verteilung von E. coli RP437 in Abwesenheit eines Konzentrationsgradienten (dh null Gefälle von Asparaginsäure), während3B und C zeigen die Verteilung in Steigungen von Asparaginsäure und NiSO _4. Die Spezifität dieser Reaktion (dh die Vorspannung in der Migration) ist offensichtlich, als E. coli RP437 Δ tar-Stammes (dh, Stamm fehlt die Tar Chemorezeptor, dass in E. coli verwendet wird, um Asparaginsäure und Nickel Sinne) nicht zeigen, die Vorspannung in der Migration in der Gegenwart eines Konzentrationsgradienten von Asparaginsäure oder NiSO _4. Die Trends evident in der räumlichen Verteilung Profile sind auch im Einklang mit den berechneten CPC und CMC-Werte. Die CPC-Werte für die Migration von E. coli RP437 in Steigungen von Asparaginsäure oder NiSO ₄ sind +0,33 und -0,33 bzw.. Die entsprechenden CMC-Werte 0,13 und -0,14 bzw.. Im Gegensatz dazu schätzt die CPC und CMC mit dem E. coli RP437 Δ tar-Stamm in Steigungen von Asparaginsäure oder NiSO ₄ sind vernachlässigbar. Darüber hinaus sind die CPC und CMC in ein Null-Gradienten von Asparaginsäure 0,03 und 0,02, bzw., und geben Sie die Unbefangenheit bei der Migration in der Abwesenheit eines Gradienten.

Abbildung 1. Geräte schematische und Konzentrationsgradienten.
(A) Schematische Darstellung der mikrofluidischen Chemotaxis Gerät. Das Gerät besteht aus einem Gradienten-Mischmodul (20 x 100 x 18750 um) und eine Chemotaxis Beobachtung Modul (20 x 1050 x 11500 um). Die Breiten der beiden Gradienten-Kanäle in das Gerät sind 500 mu m und die Breite der Bakterien Einlass ist 50 pm. Der Einschub zeigt eine Steigung von Signalmolekül (grau) und Bakterien wandern in Reaktion darauf. Live-Bakterien sind als feste Ovale dargestellt, von den toten Bakterien als offene Ovale dargestellt. (B) A Konzentrationsgradienten zwischen 0 und 100 ng / mL Fluorescein wurde in das Gerät erzeugt und aufgenommen mit Fluoreszenzmikroskopie. Fluoreszenz-Bilder wurden nach 30 min erworben und quantifiziert durch Bildanalyse.

Abbildung 2. Chemotaxis von E. coli RP437 in der mikrofluidischen Gerät.
E. coli RP437 wurde ein Gradient von exponierten (A) 0-100 uM L-Aspartat oder (B) 0 bis 225 uM NiSO ₄ in das Gerät und die Migration von lebenden Bakterien (grün) in Richtung L-Aspartat-oder weg von Nickel abgebildet alle 2,5 sec für 30 min. Tote Bakterien (rot) diente als Kontrolle für die Flow-Effekte in das Gerät. Die Bilder wurden quantifiziert mit einem in-house entwickelte Analyse program3. Die angegebenen Daten sind repräsentativ für pseudo-farbigen Bilder von drei unabhängigen Experimenten.

Abbildung 3: Quantifizierung der Migration Profile zu einem kanonischen Lockstoff und abweisend.
Räumliche Verteilung der RP437 in der mikrofluidischen Vorrichtung in Reaktion auf (A) einheitlich 100 uM L-Aspartat-(dh, keine Steigung), (B) eine 0 100 uM Gefälle von Aspartat, und (C) eine 0 225 uM Steigung NiSO ₄ . Die Verteilung der toten Zellen als durchgezogene Linie dargestellt ist, ist die Verteilung der RP437-Zellen als gestrichelte Linie dargestellt, und die Verteilung der RP437 eda ⁺ Δ tar-Zellen ist als gestrichelte Linie dargestellt. Die gezeigten Daten sind für die drei unabhängigen Experimenten gemittelt.

Discussion

Die Chemotaxis Verteilungskoeffizient (CPC) und die Chemotaxis Migration Koeffizient (CMC) kann berechnet als in Mao et al ⁵ beschrieben. Wenn eine Zelle auf die hohe Konzentration Seite erkannt wird, ist es ein Wert von +1 gegeben, während eine Zelle auf die geringe Konzentration Seite hat einen Wert von -1 gegeben ist. Die Werte werden addiert und dividiert durch die Gesamtzahl der Zellen auf die CPC zu generieren. Das Vorzeichen der CPC (positiv oder negativ) gibt die Richtung der Migration (hin oder weg von einem Signal). Obwohl die CPC zeigt an, ob Zellen zu einer chemischen Reaktion als Lockstoff oder abweisend, es nicht zu quantifizieren, inwieweit der Chemotaxis. Dafür berechnen wir die CMC, indem die räumliche Verteilung Profil von Bakterien über die Breite des Geräts in 64 Abschnitten (32 auf jeder Seite der Zelle Einlass), und die Zuordnung eines Gewichtungsfaktors an Zellen in jedem Abschnitt auf der Grundlage der Entfernung von Migration. Die Abschnitte von der Mitte (§ § 1 und 64) am weitesten von +1 (= 31.5/31.5) oder -1, da sie Zellen, die den maximalen Abstand migriert haben enthalten multipliziert. Die nächsten beiden Abschnitte (2 und 63) sind von 0,968 (= 30.5/31.5) oder -0,968 multipliziert. Die letzten beiden Abschnitte (dh, 32 und 33, die die Zelle Einlass am nächsten sind) werden von + 0.015 (= 0.5/31.5) oder -0,015 multipliziert. Die gewichteten Werte werden addiert und normiert auf die Gesamtzahl der Zellen auf die CMC zu generieren. Ein CMC von +1 bedeutet, dass alle Bakterien vollständig rückte die Steigung an der Wand der Flusskammer. Im Falle einer leichten attraktive Antwort, würde der CMC noch eine positive sein, haben aber einen kleineren Wert, während der CPC-Wert wäre noch +1. So ist die CMC diskriminiert reagieren Zellen auf das Ausmaß der Migration.

Bestimmte Parameter müssen sorgfältig kontrolliert werden, während der Durchführung Chemotaxis Experimente. Die Temperatur, bei der die Bakterien kultiviert werden, ist wichtig. Für E. coli, haben wir beobachtet, dass die besten Wachstums-Temperatur ist 32 ° C und höheren Temperaturen reduzieren die Motilität. Für bestimmte Rezeptoren werden in Bakterien, kann es notwendig sein, um die Bakterien in Gegenwart von induzierenden chemoeffector (dh die Zellen für die Chemotaxis prime) wachsen. Zum Beispiel bei der Untersuchung der Reaktion von Bakterien an Maltose, werden die Zellen mit 0,1% (w / v) der Zucker angebaut. Wenn Resuspendieren der Bakterien nach der Zentrifugation, ist es wichtig, dass leichtem Schütteln / Rollen des Rohres durchgeführt wird und die Zellen werden nicht verwirbelt. Heftiges Schütteln kann scheren die Geißeln und verringern die Beweglichkeit der Zellen getestet. Die Strömungsgeschwindigkeiten in das Gerät eingesetzt werden müssen, basierend auf die Motilität des Bakteriums getestet bestimmt werden. Langsamere Flussraten kann für Bakterien, die weniger beweglich sind erforderlich, und der optimalen Durchflussmenge muss empirisch ermittelt werden.

Wir gehen davon aus, dass die μFlow Gerät für grundlegende Untersuchungen zur bakteriellen Chemotaxis (z. B. Wettbewerb zwischen chemoeffectors für den gleichen Rezeptor) sowie bei der Identifizierung von Bakterien in Umweltproben, die für bestimmte Chemikalien, die als Lockmittel oder Repellents reagieren können verwendet werden.