Isolatie van de Mens navelstreng endotheel cellen (HUVEC)

Summary

Deze video protocol illustreert de isolatie en de cultuur van humane navelstreng endotheel cellen (HUVEC) van menselijke navelstreng. Eenmaal geïsoleerd deze cellen kunnen worden gebruikt voor in-vitro angiogenese assays, zoals de Optimized fibrinegel Bead Assay ook aangetoond door de Hughes lab.

Abstract

Angiogenese is een complexe multi-step proces, waar in reactie op de angiogene stimuli, nieuwe schepen worden gemaakt van de bestaande bloedvaten. Deze stappen zijn: afbraak van de basale membraan, proliferatie en migratie (ontspruiten) van endotheelcellen (EC) in de extracellulaire matrix, de uitlijning van de EC in de koorden, lumen vorming, anastomose, en de vorming van een nieuwe kelder membraan. Velen in vitro testen zijn ontwikkeld om dit proces te bestuderen, maar de meeste alleen maar na te bootsen bepaalde stadia van de angiogenese, en morfologisch de schepen vaak niet lijken op schepen in vivo. Hier laten we zien een geoptimaliseerd in vitro angiogenese-test dat de menselijke navelstreng EG en fibroblasten gebruikt. Dit model recapituleert alle van de belangrijkste vroege stadia van angiogenese, en vooral de schepen weer te geven patent intercellulaire lumen, omringd door gepolariseerd EC. Schepen kunnen gemakkelijk worden waargenomen door de fase-contrast-en time-lapse microscopie, en teruggewonnen in zuivere vorm voor downstream-toepassingen.

Protocol

Procedure

1. Leg het snoer op schone pad en dep het overtollige bloed. Het maken van verse snijdt aan beide uiteinden van het snoer.
2. Plaats 21 1 / 2 G naald met de plastic beschermhuls rond de naald ON, in de ader. (De ader is de grootste opening, de twee kleinere zijn slagaders)
3. Klem de naald op zijn plaats met een hemostat en bevestig de 20CC spuit van Hanks om de naald.
4. Duw de Hanks door de ader met matige druk. Verzamel het afval in het bekerglas met bleekmiddel. (Holding de naald en het snoer met een hand terwijl u de naald zou knallen uit de ader te voorkomen.) Als er veel bloed in de ader, was een tweede keer.
5. Leg het snoer op pad en klem het andere uiteinde van de ader. Vullen met een paar ml Hanks om te controleren op lekkage langs het snoer. Trek de 5 ml en verwijder de onderste klem.
6. Koppel de 20CC spuit. Verwijder de zuiger van de 10cc spuit. Bevestig de 10cc spuit aan de naald, giet 10 ml collagenase en vervang zuiger. Duw collagenase in de ader tot je de eerste bedrag af te sluiten het open einde. Re-klem het open einde en vullen met collagenase totdat er een matige uitzetting van ader. Te veel uitzetting resulteert in een gladde spieren besmetting.
7. Zachtjes masseren aan het snoer.
8. Incubeer snoer (met hemostats, naald en spuit bevestigd) in DPBS bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
9. Terwijl de incubatie, ga dan verder met stap 1-8 2 ^e koord.
10. Na de incubatie nemen koord uit beker en terwijl het snoer over de 50 ml buis knip het uiteinde boven de onderste klem. Zorg ervoor dat u alles te verzamelen in de buis. Duw de resterende collagenase via de kabel, dan bevestig de 20CC spuit en druk Hanks door met matige druk.
11. Als er geen gladde spiercellen nodig zijn, gooi het koord op dit moment. Anders, plaats op dezelfde kabel in een seconde 50 ml buis met ~ 5 ml collagenase en incubeer bij 37 ° C gedurende 30-60 minuten.
12. Houd de tube totdat alle snoeren worden gedaan.
13. Spin buizen op ~ 1200 rpm gedurende 5 minuten.
14. Aspireren supernatant (met uitzondering van ~ 1-2 ml). Resuspendeer de pellet in 5mls PHEC + en plaat in een T25.
15. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO ₂ 's nachts.
16. De volgende dag te verwijderen en te vervangen supernatant met verse media. Als er veel rode bloedcellen, een keer wassen met M199, dan PHEC + toe te voegen. Ga verder incuberen zoals gewoonlijk totdat de plaat is samenvloeiing (1-4 dagen). Gesplitst in een ontsloten T75.
17. Zodra T75 is confluent, verdeeld in drie T75s. Freeze twee flacons per fles.

Let op: endotheelcellen (niet-geactiveerde) hebben een geplaveide uiterlijk. Endotheelcellen worden soms geactiveerd (lange en puntige) direct na isolatie, na een paar passen ze meestal terug in een unactive staat.

Schoonmaken

1. Heel voorzichtig, gooi naalden in naaldencontainer.
2. Gooi spuiten in grote biohazard container.
3. Zet alle weefsel in kleine biohazard tas. Sluit zak en invriezen bij -20 ° tot verbranding.
4. Geniet van alle instrumenten in virucide gedurende minstens 10 minuten.
5. Voeg incubatie media / bleekmiddel beker afval. Laat zitten voor ten minste 10 minuten.
6. Gooi de bank pads in biologisch afval.
7. Spray langs de binnenkant en de buitenkant van bekers, werktafel, en het waterbad deksel met vircide. Laten we zitten 10 min, daarna schoon te vegen.
8. Spoel bekers en instrumenten met warm water en hangen op het rek te drogen (blot uit de instrumenten zodat ze niet roesten).
9. Afvoeren van gedecontamineerd afval in de gootsteen.
10. Ongebruikte media koelkast.
11. Gooi de handschoenen in biologisch afval.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Collagenase			10 mL per cord, warmed to 37 °C
Tissue culture flasks			T75, one per cord.
Hanks medium
scissors			sterile
beaker			sterile
50 mL tubes