Summary
Questo protocollo video illustra l'isolamento e la coltura di cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC) da cordone ombelicale umano. Una volta isolato queste cellule possono essere utilizzati per test in vitro angiogenesi come il saggio Ottimizzato fibrina Gel Bead dimostrata anche dal laboratorio di Hughes.
Abstract
L'angiogenesi è un complesso processo multi-step, in cui in risposta a stimoli angiogenici, vengono creati nuovi vasi da vasi esistenti. Questi passaggi sono: la degradazione della membrana basale, la proliferazione e la migrazione (germogliamento) delle cellule endoteliali (CE) nella matrice extracellulare, l'allineamento della CE in corde, formazione lumen, anastomosi, e la formazione di una nuova membrana basale. Molti test in vitro sono stati sviluppati per studiare questo processo, ma la maggior parte solo mimare alcune fasi dell'angiogenesi, e morfologicamente i vasi spesso non assomigliano vasi in vivo. Qui mostriamo uno ottimizzato test in vitro che utilizza l'angiogenesi umano vena ombelicale CE e fibroblasti. Questo modello racchiude in sintesi tutte le fasi iniziali della chiave dell'angiogenesi, e soprattutto i vasi visualizzazione lumen brevetto intercellulare circondato da polarizzata CE. Le navi possono essere facilmente osservati in contrasto di fase e microscopia time-lapse, e recuperato in forma pura per applicazioni a valle.
Protocol
Procedura
- Posare il cavo sul pad pulito e fuori tamponare il sangue in eccesso. Effettuare tagli freschi su entrambe le estremità del cavo.
- Inserire 21 1 / 2 aghi G con la guaina di plastica ago ON, nella vena. (La vena è la più grande apertura, i 2 più piccoli sono arterie)
- Morsetto l'ago in posizione con un hemostat e collegare la siringa 20cc di Hanks all'ago.
- Spingere il Hanks attraverso la vena con una pressione moderata. Raccogliere i rifiuti nel bicchiere con la candeggina. (Tenendo l'ago e il cavo con una mano mentre si spinge impedirebbe l'ago saltar fuori della vena.) Se c'è un sacco di sangue in vena, lavare una seconda volta.
- Posare il cavo sul pad e pinza l'altra estremità della vena. Riempire con alcuni ml di Hanks per controllare eventuali perdite lungo il cavo. Ritirare i 5 ml e scollegare il morsetto in basso.
- Staccare la siringa 20cc. Togliere lo stantuffo dalla siringa 10cc. Collegare l'ago di siringa 10cc, versare 10 ml collagenasi e sostituire pistone. Spingere collagenasi in vena fino a vedere l'ammontare prima uscita l'estremità aperta. Re-clamp l'estremità aperta e riempire con collagenasi finché non ci sarà moderata distensione della vena. Risultati distensione troppo contaminazione muscolatura liscia.
- Massaggiare delicatamente il cavo.
- Cavo di incubare (con hemostats, aghi e siringhe in allegato) in DPBS a 37 ° C per 15 minuti.
- Durante l'incubazione, continuano le operazioni 1-8 con 2 ° cavo.
- Dopo l'incubazione, prendere il cavo di coppa e tenendo il cavo sul tubo 50mL tagliare l'estremità sopra il morsetto in basso. Assicuratevi di raccogliere tutto il tubo. Spingere la collagenasi rimanenti attraverso il cavo, quindi collegare la siringa 20cc e spingere attraverso Hanks con una pressione moderata.
- Se non le cellule muscolari lisce sono necessari, eliminare il cavo in questo momento. In caso contrario, inserire il cavo stesso in una seconda 50mL tubo con collagenasi ~ 5 ml ed incubare a 37 ° C per 30-60 minuti.
- Tenere il tubo fino a quando tutti i cavi sono fatti.
- Spin tubi a ~ 1200 rpm per 5 min.
- Aspirare il surnatante (tranne che per ~ 1-2 ml). Risospendere il pellet in 5mls PHEC + e piastra in un T25.
- Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 durante la notte.
- Il giorno dopo togliere il surnatante e sostituirlo con mezzi freschi. Se ci sono molti globuli rossi, lavare una volta con M199, quindi aggiungere + PHEC. Continua l'incubazione, come al solito fino a quando la piastra è confluente (1-4 giorni). Suddiviso in gelatinizzati T75.
- Una volta T75 è confluente, diviso in tre T75s. Congelare due fiale per ogni pallone.
Nota: le cellule endoteliali (disattivo) hanno un aspetto acciottolato. Le cellule endoteliali sono a volte attivati (lungo e appuntito) subito dopo l'isolamento, dopo un paio di passaggi che di solito ritornare in uno stato non attive.
Pulizia
- Con molta attenzione, smaltire in un contenitore di aghi acuminati.
- Smaltire le siringhe in grandi contenitori a rischio biologico.
- Mettere tutto il tessuto in piccoli sacchetto. Borsa stretta e congelare a -20 ° fino a quando l'incenerimento.
- Immergere tutti gli strumenti in virucida per almeno 10 min.
- Aggiungi mezzi di incubazione di rifiuti / candeggina bicchiere. Lasciate riposare per almeno 10 min.
- Eliminare il pad in panchina rifiuti biologici.
- Spruzzare verso il basso all'interno e all'esterno di bicchieri, da banco e il coperchio bagnomaria con vircide. Lasciate riposare 10 minuti, quindi pulire.
- Lavare bicchieri e gli strumenti con acqua calda e appendere ad asciugare su rack (macchia fuori gli strumenti in modo che non ruggine).
- Smaltire i rifiuti decontaminati nel lavandino.
- Ritorna supporti non utilizzati per frigorifero.
- Smaltire i guanti in rifiuti biologici.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Collagenase | 10 mL per cord, warmed to 37 °C | ||
| Tissue culture flasks | T75, one per cord. | ||
| Hanks medium | |||
| scissors | sterile | ||
| beaker | sterile | ||
| 50 mL tubes |
