인간 제대 베인 내피 세포의 절연 (HUVEC)

Summary

이 비디오 프로토콜은 인간의 탯줄에서 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)의 고립과 문화를 보여줍니다. 일단 이러한 세포도 휴스 연구소에 의해 입증 최적화된 섬유소 젤 비드 분석처럼 체외의 angiogenesis의 assays에서 사용할 수 있습니다 고립.

Abstract

Angiogenesis는 angiogenic 자극에 대한 응답으로, 새로운 선박은 기존 vasculature에서 만들어지는 복잡한 다단계 프로세스입니다. 이 단계는 다음과 같습니다 코드, 루멘 형성, 문합, 새로운 지하 막 형성에 세포외 기질, EC의 정렬에 내피 세포의 지하 막, 증식 및 마이 그 레이션 (돋아) (EC)의 저하. 시험 관내 assays의 많은이 과정을 연구하기 위해 개발하지만, 대부분의 전용 angiogenesis의 특정 단계를 모방하고, morphologically 혈관 종종 생체내에서 선박과 유사하지되었습니다. 여기서 우리는 인간 제대 정맥 EC와 섬유아 세포를 이용 체외의 angiogenesis 분석에 최적화된 보여줍니다. 중요한 것은이 모델 recapitulates angiogenesis의 핵심 초기의, 그리고 선박 편광 EC 둘러싸인 세포 특허 루멘을 표시합니다. 선박 쉽게 위상 대조 및 시간 경과 현미경으로 관찰하고, 다운 스트림 애플 리케이션을위한 순수한 형태로 복구할 수 있습니다.

Protocol

절차

1. 초과 피를 닦아 패드와 지문에 대한 코드를 놓는다. 코드의 양쪽에 신선한 상처를 확인하십시오.
2. 정맥로, ON 플라스틱 바늘 피복과 함께 21 1 / 2 G 바늘을 삽입합니다. (정맥 최대 개방이며 2 작은 것들은 동맥 있습니다)
3. hemostat과 장소에 바늘을 고정하고 바늘로 행크스의 20cc 주사기를 첨부합니다.
4. 적당한 압력으로 정맥을 통해 행크스 밀어. 표백제와 함께 비커에 쓰레기를 수집합니다. (추진하는 것은 혈관 밖으로 터지는 바늘을 예방할하면서 한손으로 바늘과 코드를 개최.) 정맥에서 피를 많이있다면, 두 번째 시간을 씻으십시오.
5. 패드에 코드를 배치하고 정맥의 다른 쪽 끝을 클램프. 코드를 따라 누수를 확인하기 위해 행크스 몇 ML로 채웁니다. 5 ML를 철회하고 아래의 클램프를 분리합니다.
6. 20cc 주사기를 분리하십시오. 10cc 주사기의 플런저를 제거합니다. 10ml collagenase에 기름을 붓고 플런저를 교체, 바늘에 10cc 주사기를 첨부하십시오. 당신을 가장 먼저 금액은 오픈 엔드를 종료 나타날 때까지 정맥에 collagenase 밀어. 오픈 엔드를 다시 클램프 및 정맥의 중간 팽창가있을 때까지 collagenase와 함께 입력합니다. 평활근 오염에 너무 많은 팽창 결과입니다.
7. 부드럽게 코드를 마사지.
8. 15 분 37 DPBS에 품어 코드가 (첨부 hemostats, 바늘과 주사기 포함) ° C.
9. 잠복기 동안, 2 ^{차 코드와} 같이 1-8 계속합니다.
10. 부화 후 비커의 코드를 꺼내 50mL 튜브를 통해 코드를 누른 상태에서하면 하단 클램프 위의 끝부분을 잘라. 관에있는 모든를 수집해야합니다. 탯줄을 통해 나머지 collagenase를 밀어 후 20cc 주사기를 첨부하고 적당한 압력을 통해 행크스 밀어.
11. 더 평활근 세포가 필요하지 않으면,이 시간에 코드를 폐기하십시오. 그렇지 않으면, 37 ~ 5ml collagenase와 부화와 두 번째 50mL 튜브에 같은 코드를 배치 ° C를 30-60 분.
12. 모든 코드가 완료되기 전까지는 튜브를 유지.
13. 5 분 ~ 1200 RPM에서 튜브를 스핀.
14. 기음 뜨는가 (~ 1-2 ML 제외). T25에 5mls PHEC의 펠렛 +와 플레이트를 Resuspend.
15. ° C와 5 % CO ₂ 밤새 37 알을 품다.
16. 그 다음날 뜨는을 제거하고 새로운 미디어 바꿉니다. 많은 RBCs가있다면, M199과 함께 다음 PHEC +를 추가 한 번 씻으십시오. 접시 (1-4 일) 합류 전까지는 평소처럼 잠복기 계속합니다. gelatinized T75으로 가라.
17. 일단 T75 세 T75s 분할, 합류합니다. 플라스크마다 두 병을 고정.

참고 : 내피 세포 (unactivated) 조약돌 모양이 있습니다. 몇 사람들이 일반적으로 unactive 상태로 돌아가려면 통과 후 내피 세포가 때로는 바로 격리 후 (길고 뾰족한) 활성화됩니다.

대청소

1. 아주 조심스럽게, 샵스 컨테이너에 바늘 폐기.
2. 큰 생물 학적 주사기 용기에 배출.
3. 작은 생물 학적 가방에 모든 조직을 넣어. -20에서 닫기 가방 동결 ° 소각까지.
4. 적어도 10 분 virucide의 모든 악기를 만끽해보세요.
5. / 표백 비커를 낭비 부화 미디어를 추가합니다. 적어도 10 분 앉아 보자.
6. 생물 학적 폐기물로 벤치 패드를 폐기하십시오.
7. 비커, 벤치 위 vircide와 물 목욕 덮개의 내부와 외부를 스프레이. 10 분 앉아서 후 닦아냅니다.
8. 따뜻한 물을 비커와 악기를 씻어과 (그들이 녹을 않도록 악기를 얼룩) 건조 랙 만요.
9. 싱크대 아래 소독 폐기물의 배출.
10. 냉장고에 사용되지 않은 미디어를 반환합니다.
11. 생물 학적 폐기물의 장갑 폐기.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Collagenase			10 mL per cord, warmed to 37 °C
Tissue culture flasks			T75, one per cord.
Hanks medium
scissors			sterile
beaker			sterile
50 mL tubes