Isolering av mänskliga Endothelial Umbilical Vein Cells (HUVEC)

Summary

Denna video protokoll illustrerar isolering och odling av mänskliga endotelceller navelsträng ven celler (HUVEC) från människa navelsträngen. När isolerade dessa celler kan användas för in vitro-angiogenes-analyser som Optimerad Fibrin Gel Bead-analys också bevisas av Hughes labbet.

Abstract

Angiogenes är en komplicerad process i flera steg, där som svar på angiogena stimuli, nya fartyg skapas från den befintliga kärlbädden. Dessa åtgärder inkluderar: nedbrytning av basalmembranet, spridning och migration (spirande) av endotelceller (EG) i den extracellulära matrisen, anpassning av EG i sladdar, lumen bildning, anastomos och bildandet av en ny basalmembranet. Många in vitro-tester har utvecklats för att studera denna process, men de flesta bara härma vissa skeden av angiogenes, och morfologiskt fartygen ofta inte liknar fartygen in vivo. Här visar vi ett optimerat in vitro-angiogenes test som använder mänskliga EG navelsträngen ven och fibroblaster. Denna modell rekapitulerar alla de viktigaste tidiga stadierna av angiogenes, och viktigast fartygen displayen patentet intercellulära lumen omgiven av polariserad EG. Fartyg kan lätt observeras av faskontrast och Time-lapse mikroskopi och som återvinns i ren form för tillämpningar i efterföljande led.

Protocol

Förfarande

1. Lägg sladden på rena pad och badda bort överflödigt blod. Gör färska snitt i båda ändarna av sladden.
2. Sätt in 21 1 / 2 G nål med plast nålskyddet på, in i venen. (Den ven är den största öppningen, med de 2 mindre är artärer)
3. Spänn nålen på plats med en hemostat och fäst 20CC spruta av Hanks till nålen.
4. Tryck Hanks genom venen med måttligt tryck. Samla avfallet i bägaren med blekmedel. (Håll nålen och rep med en hand samtidigt som du trycker skulle förhindra nålen poppar ut ur venen.) Om det finns en hel del blod i venen, tvätta en gång till.
5. Lägg sladden på pad och klämma den andra änden av venen. Fyll på med några ml Hanks att kolla efter läckor längs sladden. Dra ut 5 ml och koppla ner klämman.
6. Koppla bort 20CC sprutan. Ta bort kolven från 10cc spruta. Fäst 10cc spruta med nål, häll i 10 ml kollagenas och byt kolven. Tryck kollagenas i ven tills du ser den första beloppet avsluta den öppna änden. Re-clamp den öppna änden och fyll med kollagenas tills det är måttlig uttänjning av ven. För mycket dilatation resulterar i glatt muskulatur kontaminering.
7. Massage sladden försiktigt.
8. Inkubera sladd (med peanger, nål och spruta bifogas) i DPBS vid 37 ° C i 15 min.
9. Medan inkuberar fortsätter steg 1-8 med 2: ^a sladd.
10. Efter inkubation, ta sladden ur bägare och medan du håller sladden över 50mL röret skär slutet ovanför botten klämman. Var noga med att samla allt i röret. Tryck återstående kollagenas genom sladden, anslut sedan 20CC sprutan och tryck Hanks igenom med måttligt tryck.
11. Om ingen glatta muskelceller behövs, kasta linan vid denna tid. Annat sätt, för samma kabel till en andra 50mL rör med ~ 5ml kollagenas och inkubera vid 37 ° C i 30-60 min.
12. Håll röret tills alla sladdar är klar.
13. Spin rör vid ~ 1200 rpm under 5 minuter.
14. Sug ut supernatant (utom för ~ 1-2 ml). Återsuspendera pelleten i 5mls PHEC + och plattan i en T25.
15. Inkubera vid 37 ° C med 5% CO ₂ över en natt.
16. Nästa dag bort supernatanten och ersätta med nya medier. Om det finns många röda blodkropparna, tvätta en gång med M199, lägg sedan till PHEC +. Fortsätt inkuberar som vanligt tills plattan är konfluenta (1-4 dagar). Delas upp i en gelatiniserad T75.
17. När T75 är konfluenta, uppdelad i tre T75s. Freeze två flaskor per flaska.

Obs: endotelceller (inaktiverad) har en kullersten utseende. Endotelceller är ibland aktiveras (lång och spetsig) direkt efter isolering, efter ett par går de oftast tillbaka in i en unactive tillstånd.

Cleanup

1. Mycket noga, kasta nålar i avfallsbehållare.
2. Kasta sprutor i stora biologiskt behållare.
3. Lägg alla vävnader i små biologiskt väska. Stäng påsen och frys vid -20 ° tills förbränning.
4. Blötlägg alla instrument i virucide i minst 10 min.
5. Lägg inkubation media avfall / bleka bägare. Låt sitta i minst 10 min.
6. Kasta bänken kuddar i biologiskt avfall.
7. Spraya ner insidan och utsidan av bägare, bänkskiva och vattenbad lock med vircide. Låt sitta 10 minuter och sedan torka.
8. Skölj bägare och instrument med varmt vatten och hänga på rack för att torka (blot av instrumenten så att de inte rost).
9. Kassera sanerat avfall i vasken.
10. Tillbaka oanvända media till kylskåp.
11. Kasta handskar i biologiskt avfall.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Collagenase			10 mL per cord, warmed to 37 °C
Tissue culture flasks			T75, one per cord.
Hanks medium
scissors			sterile
beaker			sterile
50 mL tubes