Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC)

Summary

Dieses Video-Protokoll zeigt die Isolierung und Kultivierung der menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) aus humanen Nabelschnur. Nach der Isolierung dieser Zellen in vitro Angiogenese-Assays, wie die optimierte Fibringel Bead Assay auch durch die Hughes-Labor nachgewiesen werden kann, verwendet werden.

Abstract

Die Angiogenese ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, in dem in Reaktion auf angiogene Stimuli, neue Schiffe aus dem bestehenden Gefäßsystem geschaffen werden. Diese Schritte sind: Abbau der Basalmembran, die Proliferation und Migration (sprießen) von Endothelzellen (EC) in der extrazellulären Matrix, die Ausrichtung der EG zu Schnüren, Lumenbildung, Anastomose, und die Bildung einer neuen Basalmembran. Viele in-vitro-Assays wurden entwickelt, um diesen Prozess zu studieren, aber die meisten nur imitieren bestimmte Stadien der Angiogenese und morphologisch die Schiffe oft nicht Schiffe in vivo ähneln. Hier zeigen wir ein in vitro-Angiogenese-Assay, der menschlichen Nabelvene EG und Fibroblasten nutzt optimiert. Dieses Modell rekapituliert alle wichtigen frühen Phasen der Angiogenese, und, noch wichtiger die Gefäße Display Patent interzellulären Lumen durch polarisiertes EG umgeben. Schiffe können leicht durch Phasen-Kontrast-und Zeitraffer-Mikroskopie beobachtet werden, und erholte sich in reiner Form für nachgelagerte Anwendungen.

Protocol

Verfahren

1. Lay Schnur auf saubere Unterlage und tupfen Sie überschüssiges Blut. Machen Sie frische Schnittwunden an beiden Enden der Schnur.
2. Einsatz 21 2.1 G Nadel mit dem Kunststoff Injektionsnadelhülle ON, in die Vene. (Die Vene wird die größte Öffnung, die 2 kleineren sind Arterien)
3. Klemmen Sie die Nadel im Ort mit einem hemostat und befestigen Sie die 20cc Spritze Hanks an der Nadel.
4. Drücken Sie die Hanks durch die Vene mit mäßigem Druck. Sammeln Sie die Abfälle in das Becherglas mit Bleichmittel. (Holding der Nadel und Schnur mit einer Hand, während Sie die Nadel mit Ausbrüchen aus der Vene verhindern würde.) Wenn es eine Menge Blut in der Vene, waschen ein zweites Mal.
5. Lay Schnur am Pad und klemmen Sie das andere Ende der Vene. Füllen Sie mit ein paar ml Hanks auf Lecks an der Schnur zu überprüfen. Ziehen Sie die 5 mL und ziehen Sie den unteren Klemme.
6. Trennen Sie die 20cc Spritze. Entfernen Sie den Kolben aus der 10cc Spritze. Bringen 10cc Spritze Nadel, pour in 10ml Kollagenase und ersetzen Kolben. Push-Kollagenase in die Vene, bis Sie die erste Ausfahrt Menge das offene Ende. Re-clamp das offene Ende und füllen sich mit Kollagenase, bis es moderate Ausdehnung der Vene. Zu viel distention Ergebnisse in der glatten Muskulatur Kontamination.
7. Massage der Schnur sanft.
8. Inkubieren Kabel (mit Arterienklemmen, Nadel und Spritze befestigt) in DPBS bei 37 ° C für 15 min.
9. Während der Inkubation weiterhin die Schritte 1-8 mit 2 ^nd Kabel.
10. Nach der Inkubation nehmen Schnur von Becher und bei gedrückter Schnur über die 50ml Tube geschnitten Ende über dem Boden befestigen. Achten Sie darauf, alles in der Röhre zu sammeln. Schieben Sie die restlichen Kollagenase durch die Schnur, dann bringen Sie die 20cc Spritze und drücken Hanks durch mit mäßigem Druck.
11. Wenn keine glatten Muskelzellen benötigt werden, verwerfen die Schnur zu diesem Zeitpunkt. Andernfalls setzen die gleichen Kabel in einem zweiten 50 mL Röhrchen mit 5ml ~ Kollagenase und bei 37 ° C für 30-60 min.
12. Halten Sie das Rohr, bis alle Kabel fertig sind.
13. Spin-Röhrchen bei ~ 1200 rpm für 5 min.
14. Saugen Sie den Überstand (mit Ausnahme von ~ 1-2 mL). Pellet in 5mls PHEC + und Platte in einer T25.
15. Bei 37 ° C mit 5% CO ₂ über Nacht.
16. Am nächsten Tag entfernen Überstand und ersetzen mit frischen Medien. Wenn es viele Erythrozyten sind, einmal abwaschen mit M199, dann fügen Sie PHEC +. Weiter Inkubation wie gewohnt, bis die Platte ist konfluent (1-4 Tage). Aufgeteilt in eine gelatinierte T75.
17. Sobald T75 ist konfluent, aufgeteilt in drei T75s. Einfrieren zwei Fläschchen pro Flasche.

Hinweis: Endothelzellen (nicht aktivierte) haben einen gepflasterten Aussehen. Endothelzellen sind manchmal aktiviert (lang und spitz) direkt nach Isolation, nach ein paar Durchgängen sie in der Regel in eine unactive Zustand zurückzukehren.

Cleanup

1. Sehr vorsichtig, von Nadeln in Entsorgungsboxen entsorgen.
2. Entsorgen von Spritzen in großen Behälter für biologischen.
3. Legen Sie alle Gewebe in kleine Beutel für biologisches Risikomaterial. Close Tasche und bei -20 ° bis Verbrennung.
4. Weichen Sie alle Instrumente in viruzid für mindestens 10 min.
5. Add Inkubation Medien / Bleiche Becher Abfall. Lassen Sie sitzen für mindestens 10 min.
6. Entsorgen Sie die Bank-Pads in biohazard Abfall.
7. Spray auf der Innen-und Außenseite Becher, Arbeitstisch und im Wasserbad Deckel mit vircide. Lassen Sie sitzen 10 min, dann wischen.
8. Spülen Sie Becher und Instrumente mit warmem Wasser und hängen am Regal zum Trocknen (abtupfen die Instrumente, damit sie nicht rosten).
9. Entsorgen dekontaminiert Abfälle in den Ausguss.
10. Nicht verwendete Medien Kühlschrank.
11. Entsorgen von Handschuhen in biohazard Abfall.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Collagenase			10 mL per cord, warmed to 37 °C
Tissue culture flasks			T75, one per cord.
Hanks medium
scissors			sterile
beaker			sterile
50 mL tubes