Summary
आदेश दिया झिल्ली प्रोटीन arrays के गठन के लिए दो आयामी (2d) crystallization परीक्षण का मूल्यांकन इलेक्ट्रॉन क्रि में एक बेहद महत्वपूर्ण और मुश्किल काम है. 90kDa - हम यहाँ के लिए स्क्रीनिंग और 15 की रेंज में मुख्य रूप से छोटे झिल्ली प्रोटीन की 2D क्रिस्टल की पहचान में हमारे दृष्टिकोण का वर्णन.
Abstract
इलेक्ट्रॉन क्रि एक तरीका है कि या तो वैकल्पिक रूप से या तीन आयामी crystallization और एक्स - रे क्रि झिल्ली प्रोटीन की संरचना समारोह सवाल है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से घुलनशील प्रोटीन का अध्ययन करने के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में विकसित किया गया है. दो आयामी (2d) के संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा क्रिस्टल के लिए स्क्रीनिंग (EM) को ढूँढने में महत्वपूर्ण कदम है, अनुकूलन, और क्रायो-EM द्वारा उच्च संकल्प डेटा संग्रह के लिए नमूने का चयन. यहाँ हम दोनों बड़े और आदेश दिया, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से छोटे 2 डी सरणियों, कि संभावित crystallization शर्तों के अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण जानकारी की आपूर्ति कर सकते हैं की पहचान करने में बुनियादी कदम का वर्णन.
EM पर विभिन्न magnifications के साथ काम करके, महत्वपूर्ण पैरामीटर की एक श्रृंखला पर डेटा प्राप्त की है. लोअर बढ़ाई आकारिकी और झिल्ली के आकार पर मूल्यवान डेटा की आपूर्ति करता है. उच्च magnifications में, संभव क्रम और 2d क्रिस्टल आयाम निर्धारित होते हैं. इस संदर्भ में, यह वर्णित है कैसे सीसीडी कैमरों और ऑनलाइन - फूरियर रूपांतरण उच्च magnifications पर इस्तेमाल कर रहे हैं करने के लिए आदेश और आकार के लिए proteoliposomes का आकलन है.
जबकि झिल्ली प्रोटीन की 2D क्रिस्टल सबसे अधिक डायलिसिस द्वारा पुनर्गठन द्वारा बड़े हो रहे हैं, स्क्रीनिंग तकनीक monolayers, देशी 2D क्रिस्टल की मदद के साथ उत्पादित क्रिस्टल के लिए समान रूप से लागू है, और घुलनशील प्रोटीन की सरणियों का आदेश दिया. इसके अलावा, यहाँ वर्णित विधियों को भी छोटे 2 डी क्रिस्टल के रूप में अच्छी तरह के रूप में बड़ा झिल्ली प्रोटीन, जहां छोटे प्रोटीन की पहचान में हमारे बड़े प्रोटीन की जाली और उदाहरण के रूप में देखभाल के एक ही राशि की आवश्यकता के लिए स्क्रीनिंग के लिए लागू कर रहे हैं और अधिक आसानी से पहचाने जाने योग्य हो सकता है स्क्रीनिंग के पहले चरण में.
Protocol
1. 2D Crystallization परीक्षण के ग्रिड तैयार
- कार्बन लेपित 400 जाल तांबा EM ग्रिड नकारात्मक दाग द्वारा तैयार कर रहे हैं. Uranyl एसीटेट अक्सर प्रयोग किया जाता है और उपयुक्तता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ग्रिड के दीर्घकालिक भंडारण के लिए उपयोग से पहले कई महीनों के लिए एक लंबे समय से स्थायी समाधान के भंडारण के मामले में दाग प्रदान करता है. इसके विपरीत, uranyl formate जैसे अन्य नकारात्मक दाग, जबकि उत्कृष्ट धुंधला प्रदान हौसले से एक बनाया जा जरूरत है. 2D crystallization परीक्षण की स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा ग्रिड की एक बड़ी संख्या के तेजी से तैयार करने के लिए, नकारात्मक धुंधला का एक संशोधित संस्करण का प्रयोग किया जाता है. नमूना के 2 μL के एक मात्रा में कार्बन कवर EM ग्रिड पर pipetted है और 60 एस के लिए incubated यह वाटमान की एक फटे टुकड़ा # 4 फिल्टर पेपर (चित्रा 1, वीडियो) के साथ बढ़त से सोख्ता द्वारा पीछा किया जाता है, तो 1% uranyl एसीटेट के 2 μL तुरंत लागू कर रहे हैं, जो फिर से के बाद 30 ग्रिड के किनारे से blotted एस फिल्टर कागज के फटे बढ़त के साथ रिम पर ग्रिड मार्मिक proteoliposomes को हटाने के बिना तरल के इष्टतम हटाने सुनिश्चित करता है. इसके अलावा, ग्रिड के किनारे पर सुखाने कार्बन फिल्म के बेहतर संरक्षण सुनिश्चित करता है. केयर तैयारी और ग्रिड की हैंडलिंग में लिया जाना चाहिए, के रूप में नाजुक कार्बन फिल्म का टूटना नमूना आसंजन रोकता है और नमूने के एक गलत प्रतिनिधित्व में परिणाम कर सकते हैं. जबकि 5 μL के परंपरागत बड़ा नमूना संस्करणों थे और नियमित ग्रिड तैयारी के लिए इस्तेमाल किया, कीमती नमूने 2 μL या कम 2 की मात्रा को कम करने से बचाया जा सकता है.
- सबसे बड़ा संभव झिल्ली का उत्पादन करने के लिए, हमारे कुछ नमूनों की ग्लिसरॉल या sucrose के उच्च सांद्रता (10-20%) डायलिसिस बफर में उपस्थित होने के लिए आवश्यकता होती है. इस ग्रिड तैयार करने पर एक नकारात्मक प्रभाव है, के रूप में ग्लिसरॉल या sucrose अत्यधिक चिपचिपा है और ठीक से बफर मर्मज्ञ, और इस प्रकार अधूरे झिल्ली धुंधला से uranyl एसीटेट रोकता कर सकते हैं. नतीजतन एक संभव जाली छिप जाएगा. या तो बफर और नमूने / ग्लिसरॉल sucrose मुक्त बफर () नहीं दिखाया, या ग्रिड द्वारा प्रतिस्थापन के centrifugation से विमर्श किया जा सकता करने के लिए इसी तरह की नकारात्मक धुंधला पहले बफर या कई चक्रों में एक ग्लिसरॉल / sucrose - मुक्त बफर के साथ धोया जा सकता है है क्रायो-EM 3,4 के लिए तकनीक का इस्तेमाल .
2. EM द्वारा 2D Crystallization परीक्षण मूल्यांकन
- नमूना धारक के प्रकार पर निर्भर करता है, या तो एक या एकाधिक ग्रिड लोड कर रहे हैं. 2-10K, जो मध्यवर्ती बढ़ाई के रूप में करने के लिए यहाँ भेजा जाएगा के एक बढ़ाई, औसत और झिल्ली, आकारिकी, और आकार, जो प्रयोगशाला नोटबुक में 5 का नोट ले लिया है के फैलाव का वितरण हद तक की एक पहली छाप के लिए अनुमति देता है. उपयुक्त क्षेत्रों में एक सीसीडी कैमरे की मदद के साथ प्रतिनिधि overviews के रूप में दर्ज कर रहे हैं, या यदि एक सीसीडी कैमरा उपलब्ध है, फिल्म पर नहीं है.
- मोटे तौर पर 400 800x की सीमा में कम बढ़ाई कई बार प्रयोग किया जाता है जब पूरे नमूना / ग्रिड के एक सिंहावलोकन वांछित है. जबकि हर ग्रिड के साथ कार्यरत नहीं है, कम बढ़ाई ग्रिड की तैयारी के कई पहलुओं के संदर्भ में मूल्यांकन में मदद की बहुमूल्य जानकारी देता है: दोनों नकारात्मक धुंधला हो जाना और कार्बन फिल्म, ग्रिड पर नमूना एकाग्रता है, और संभवतः असमान proteoliposome वितरण के संभावित आंशिक टूटना. व्यक्तिगत ग्रिड वर्गों दूरबीन या सीसीडी कैमरे के साथ देखा जा सकता है है. कुछ ईएमएस के साथ यह संभव है के लिए विशेष ब्याज की स्थिति है, जो उच्च magnifications पर बाद में निरीक्षण के लिए याद किया जा सकता है को बचाने के.
- एक बार ब्याज की एक ग्रिड क्षेत्र या तो कम या मध्यवर्ती बढ़ाई पर पहचान की गई है, लगभग 60k-50K बढ़ाई करने के लिए बदल जाता है. झिल्ली, क्रिस्टल, और इकाई कोशिका का आकार पर निर्भर करता है, अगर जाना जाता है, 30K के रूप में कम और 80k के रूप में के रूप में उच्च के रूप में magnifications उपयोग किया जाता है. 30-80k रेंज बढ़ाई 2D क्रिस्टल के लिए स्क्रीनिंग के प्रयोजन के लिए उच्च वृद्धि के रूप में भेजा जाएगा. केंद्रित कम खुराक सेट अप का ध्यान केंद्रित सेटिंग में या तो छवि / फोटो सेटिंग के लिए, या हित के क्षेत्र के आसपास के क्षेत्र में बाद में स्विच के साथ होता है.
- कि क्या वास्तव में ब्याज के क्षेत्र में एक झिल्ली में अस्पष्टता के मामलों में, कार्बन फिल्म के लिए नमूना proteoliposomes, अभ्रक, या अन्य कलाकृतियों के आकार में निरीक्षण किया है. इस प्रयोजन के लिए, किनारों ठेठ तह और आकारिकी प्रकट करते हैं.
- अब हित के क्षेत्र के एक सीसीडी कैमरे के साथ निरीक्षण किया है. 30K 80k बढ़ाई पर एक सीसीडी छवि एकत्र किया जाता है, झिल्ली के आकार, प्रोटीन या इकाई कोशिका का आकार पर निर्भर करता है, या क्रिस्टलीय क्षेत्र ज्ञात. एक छोटे और / या ज्यादातर हाइड्रोफोबिक झिल्ली प्रोटीन की जाली जरूरी सीसीडी छवि ही दृश्य मूल्यांकन द्वारा दिखाई नहीं है. या तो पूरी छवि एक ऑनलाइन फूरियर परिवरतित (एफटी, या तेजी से एफटी-FFT) के लिए प्रयोग किया जाता है. इस एफटी शोर का एक महत्वपूर्ण राशि शामिल है, लेकिन अगर आदेश दिया सरणी छोटा है. इस प्रकार, एक कम बॉक्सिंग छवि आकार एक smal के एक बेहतर संकेत से शोर अनुपात के लिए अनुमति देगाler क्रिस्टल और आसान पहचान. इस प्रयोजन के लिए, बॉक्स छवि पर ले जाया जाता है और एक जीवित एफटी मूल्यांकन किया जाता है.
/ बीम की तीव्रता चमक नमूना के लिए कम खुराक शर्तों, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मन में सीसीडी कैमरा सेटिंग्स रखने के लिए निकाला जाता है. कैमरा इस्तेमाल किया सीसीडी पर निर्भर करता है, जीना एफटी के गामा आदेश दिया arrays के इष्टतम पहचान के लिए निकाला जाता है. एक पीढ़ी उच्च मूल्य शोर योगदान के कारण स्पॉट अस्पष्ट कर सकते हैं, और एक जरूरत से ज्यादा कम गामा मूल्य जा रहा है की पहचान से कमजोर धब्बे को रोकने जाएगा. इन कमजोर स्पॉट शोर के स्तर से ऊपर बमुश्किल एफटी में धब्बों के साथ छोटे क्रिस्टलीय arrays के लिए कारण हो सकता है.
जबकि उच्च संकल्प पर डेटा 6 नमूनों की एक छोटी संख्या के में एकत्र किया गया है, आमतौर पर नकारात्मक दाग 2D क्रिस्टल का संकल्प सीमित है या मोटे तौर पर 15A संकल्प की तुलना में बेहतर हो उम्मीद नहीं की जाना चाहिए. साथ लगभग -400 एनएम के defocus, नहीं धब्बे के 1-3 से अधिक आदेश को आसानी से पहचाना जा उम्मीद कर रहे हैं. नमूने आम तौर पर मूल्यांकन कर रहे हैं समाधान के लिए नहीं, क्रायो - EM डेटा संग्रह के रूप में प्राप्त उच्चतम संकल्प के एक उचित संकेत दे देंगे. धब्बे और संभव mosaicity के सुस्पष्टता हालांकि नोट कर रहे हैं.
- विभिन्न झिल्ली के रूप में के रूप में अच्छी तरह से झिल्ली morphologies, आदेश के लिए उच्च वृद्धि पर मूल्यांकन कर रहे हैं. यह शुरुआत या 2D crystallization परीक्षण के मध्यवर्ती चरणों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, बजाय छोटे बड़ा proteoliposomes या झिल्ली पैच के रूप में सबसे होनहार क्षेत्रों को शामिल कर सकते हैं. 2 डी क्रिस्टल के बहुत कम प्रतिशत छवि के अधिग्रहण और एफटी, या छवियों आदेश दिया arrays के प्रारंभिक पहचान के बाद से अक्सर आकार और गुणवत्ता 2,4,7 के तेजी से सुधार के लिए नेतृत्व करेंगे की एक बड़ी संख्या के ऑप्टिकल विवर्तन, की आवश्यकता होगी.
3. प्रतिनिधि परिणाम
आदर्श रूप में आदेश दिया proteoliposomes आसानी से पहचानने योग्य, तेज स्पॉट प्रदर्शित करते हैं. बड़े और अच्छी तरह का आदेश दिया क्रिस्टल आसानी से ऑनलाइन - एफटी सीसीडी छवियों या micrographs के ऑप्टिकल विवर्तन के द्वारा पहचाने जाते हैं.
उदाहरण के 18kDa है कि आकार में कई microns से कर रहे हैं की एक छोटी झिल्ली प्रोटीन के 2D क्रिस्टल से पता चलता है है. एफटी पर स्पॉट को आसानी से पहचान कर रहे हैं और तेज है. रहते एफटी बॉक्स के आंदोलन से पता चलता है कि जाली mosaicity बिना सतत है. EM के छोटे परदे पर एक अधिक व्यापक घुलनशील डोमेन के साथ एक बड़ा प्रोटीन की जाली पहचाना जा सकता है है. सीसीडी छवि संग्रह और एफटी बेहतर आकलन के एक साधन प्रदान करने के लिए और, उदाहरण के लिए, संभव mosaicity (शो एफटी) पर जानकारी हासिल करने के लिए आवश्यक है. जब एक proteoliposome आदेश दिया है कि नहीं एक एफटी गणना, शोर शुरू में स्थानों के लिए गलत किया जा सकता है. जबकि रहते एफटी के लिए बॉक्स में ले जाया जाता है, तथापि, स्पॉट गायब हो जाएगा. दूसरी ओर, छोटे arrays, संदिग्ध crystallinity के साथ, अपने स्थिर शेष स्पॉट जब रहते एफटी थोड़ा भी छवि क्षेत्र पर ले जाया जाता है होगा. इसके अलावा, इन छोटे क्रिस्टल आमतौर पर एक ही इकाई सेल आकार होने के द्वारा मान्यता प्राप्त किया जा सकता है है, और अलग FTS में धब्बे के बीच दूरी को इस तरह के रूप में विभिन्न, एक विशिष्ट आकार का एक चक्र के साथ तरीके में मापा जा सकता है. लिपिड क्रिस्टल एक अलग जाली आकारिकी और एफटी प्रदर्शित करते हैं.
प्रारंभिक परीक्षणों में तेज़ी मुठभेड़ असामान्य नहीं है. यहाँ पुनर्गठन के बिना प्रोटीन वर्षण हालांकि छोटे लिपिड समुच्चय से प्रतिष्ठित किया जा जरूरत है. नमूने है कि कम बढ़ाई precipitates होना दिखाई देते हैं अक्सर बाहर बारी के लिए लिपिड समुच्चय जा सकता है जब उच्च बढ़ाई देखा. 30-50K पर निरीक्षण करने पर, इन संरचनाओं के अंधेरे किनारों उन्हें प्रोटीन का कोई वर्षा के साथ झिल्ली से बना प्रकट करते हैं. इन महत्वपूर्ण टिप्पणियों के रूप में लिपिड समुच्चय बड़े झिल्ली के आकार में हो सकता है निम्नलिखित प्रयोगों में वृद्धि कर रहे हैं.
मूल्यांकन नमूनों में गरीब परिणाम कभी कभी एक कम झिल्ली एकाग्रता है कि उचित और तेजी से स्क्रीनिंग रोकता से जुड़े हैं. यह अक्सर 2D crystallization के लिए एक उच्च प्रोटीन एकाग्रता की डायलिसिस द्वारा उपयोग के साथ दूर किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, झिल्ली भंडारण के दौरान Eppendorf ट्यूब के तल पर कुछ दिनों के लिए व्यवस्थित करने के लिए छोड़ा जा सकता है है. झिल्ली के तेजी से, या लगभग तुरंत निपटाने के कुछ मामलों में होता है और ट्यूब के नीचे से pipetting ग्रिड पर एक उच्च घनत्व झिल्ली में परिणाम देगा. एक और बहुत तेजी से विकल्प ट्यूब के नीचे से बाद में नमूने के साथ नमूने की centrifugation (3000-8000 rpm पर 1-3 मिनट के लिए) है.
इष्टतम शर्तों के तहत नमूने 2D क्रिस्टल का एक बड़ा प्रतिशत हो जाएगा. यह झिल्ली के एक सजातीय उपस्थिति के लिए उद्देश्य के लिए आवश्यक है, सबसे बड़ा और सबसे अच्छी तरह से आदेश दिया 2D क्रिस्टल नेत्रहीन से डेटा के लिए चयन कर रहे हैं संग्रह के रूप में नहीं है. नमूने के इन प्रकार आसानी से हो सकता है जब crystallization परीक्षण के रूप में अच्छी तरह से जब नमूने के लिए उपयोग किया जाता है दोहराया जाता है मान्यता प्राप्त होगाक्रायो - EM डेटा संग्रह, उच्च संकल्प छवियों की अधिकतम संख्या में जिसके परिणामस्वरूप.
चित्रा 1 यह आंकड़ा वाटमान की एक फटे टुकड़ा # 4 फिल्टर पेपर के साथ ग्रिड के किनारे सोख्ता से पता चलता है.
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Discussion
नमूनों के उचित मूल्यांकन झिल्ली के एक पर्याप्त संख्या के सावधान मूल्यांकन की आवश्यकता है. उदाहरण के लिए, के रूप में कम 2% के रूप में 180 से अधिक imaged proteoliposomes की क्रिस्टलीय सरणियों के साथ नमूने 2D crystallization 7 शर्तों के त्वरित अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण जानकारी दी .
जब प्रोटीन की वर्षा होती है, एक ग्रिड कम बढ़ाई पर निरीक्षण के बाद आगे की स्क्रीनिंग से छोड़ दिया हो सकता है, हालांकि प्रोटीन की कभी कभी आंशिक वर्षा होती है. यहां तक कि कम से कम 100 एनएम के बहुत छोटे झिल्ली हालांकि आदेश के बारे में उपयोगी जानकारी दे, कर सकते हैं और 2D क्रिस्टल आकार को बढ़ाने के मापदंडों निम्न डायलिसिस प्रयोगों में लागू किया जा सकता है.
प्रयोगशालाओं 8,9 स्क्रीनिंग की प्रक्रिया में होनहार स्वचालन के विभिन्न डिग्री शुरू करने की प्रक्रिया में हैं. फिर भी नमूने अभी भी 2D क्रिस्टल आकार, आकृति विज्ञान, और व्यवस्था के मूल्यांकन और ज्ञान के चरणों की आवश्यकता के रूप में यहाँ रेखांकित किया जाएगा. भविष्य में, यह संभव हो उच्च संकल्प के लिए तेजी से छोटे 2 डी क्रिस्टल के डेटा का विश्लेषण करने के लिए, शायद इन स्क्रीनिंग कदम और छोटे क्रिस्टलीय और भी अधिक महत्वपूर्ण क्षेत्रों में से एक और अधिक कठिन मूल्यांकन करने.
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Acknowledgments
हम बहुमूल्य प्रोटीन के नमूने, जो हमारे तरीके से संबंधित अनुभव और टिप्पणियों के कुछ योगदान प्रदान करने के लिए अपने सहयोगियों का धन्यवाद. गुंठर Schmalzing कृपया FR करने का अवसर प्रदान करने के लिए इस परियोजना में शामिल होने. बारबरा Armbruster, याकूब कगार और Deryck मिल्स उनके बकाया मदद और उपकरणों पर इनपुट के लिए धन्यवाद दिया. अनुदान NIH अनुदान HL090630 द्वारा प्रदान की गई थी.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | |||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | ||
| Micropipette and pipette tips | |||
| Whatman #4 filter paper | |||
| 1% uranyl acetate | |||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | |||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | ||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
References
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