Summary
Auswertung zweidimensionaler (2D) Kristallisation Studien für die Bildung geordneter membrane protein-Arrays ist eine höchst kritische und schwierige Aufgabe in Elektronenkristallographie. Hier beschreiben wir unseren Ansatz in Screening und Identifizierung von 2D-Kristallen von überwiegend kleinen Membranproteine im Bereich von 15 - 90kDa.
Abstract
Electron Kristallographie als eine Methode, die entweder alternativ oder in Kombination mit dreidimensionalen Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse zu Struktur-Funktions-Anfragen von Membranproteinen sowie lösliche Proteine Studie verwendet werden entwickelt. Screening für die zweidimensionale (2D) Kristalle mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie (EM) ist der kritische Schritt bei der Suche, Optimierung und Auswahl Proben für hochauflösende Datenerfassung durch Kryo-EM. Hier beschreiben wir die grundlegenden Schritte bei der Identifizierung von großen und bestellt, als auch kleine 2D-Arrays, die potenziell liefern können wichtige Informationen zur Optimierung der Kristallisationsbedingungen.
Durch die Zusammenarbeit mit unterschiedlichen Vergrößerungen an der EM werden die Daten über eine Reihe von kritischen Parametern erhalten. Lower Vergrößerung liefert wertvolle Daten über die Morphologie und Membran Größe. Bei höheren Vergrößerungen sind möglich, um-und 2D-Kristall Dimensionen ermittelt. In diesem Zusammenhang wird beschrieben, wie CCD-Kameras und Online-Fourier-Transformationen bei höheren Vergrößerungen werden verwendet, um Proteoliposomen für Ordnung und Größe zu beurteilen.
Während 2D-Kristalle von Membranproteinen am häufigsten durch Rekonstitution durch Dialyse gewachsen sind, ist die Screening-Technik gleichermaßen für Kristalle mit Hilfe von Monoschichten, native 2D-Kristalle hergestellt und Anordnungen von löslichen Proteinen. Darüber hinaus sind die hier beschriebenen Methoden für das Screening für 2D-Kristalle von noch kleineren als auch größeren Membranproteine, wo kleinere Proteine erfordern die gleiche Sorgfalt bei der Identifikation wie unsere Beispiele und das Gitter von größeren Proteinen könnte besser erkennbar sein in früheren Stadien des Screenings.
Protocol
1. Grid Vorbereitung der 2D-Kristallisation Trials
- Carbon-beschichtete 400-Mesh-Kupfer EM Gitter sind durch negative Färbung vorbereitet. Uranylacetat wird häufig verwendet und bietet einen lang anhaltenden im Hinblick auf die Lagerung der Lösung Fleck für mehrere Monate vor dem Einsatz sowie die Eignung für die langfristige Speicherung von Grids. Im Gegensatz dazu benötigen andere negative Flecken wie Uranyl Formiat, bei gleichzeitig ausgezeichneter Färbung frisch hergestellt werden 1. Für die schnelle Herstellung einer großen Anzahl von Netzen, um für das Screening von 2D-Kristallisation Studien verwendet werden, ist eine modifizierte Version von negativen Färbung verwendet. Ein Volumen von 2 ul der Probe wird auf eine Kohlenstoff-bedeckten EM Gitter pipettiert und 60 s. Diese durch Blotten von der Kante mit einem zerrissenen Stück Whatman Nr. 4 Filterpapier (Abbildung 1; Video) gefolgt wird, und dann 2 ul 1% Uranylacetat werden sofort angewendet werden, die wiederum vertilgt von der Kante des Gitters nach 30 s. Durch Berühren des Rasters auf die Felge mit den zerrissenen Rand des Filterpapiers sorgt für eine optimale Entfernung von Flüssigkeit ohne Entfernung der Proteoliposomen. Darüber hinaus sorgt Trocknen an der Kante des Gitters verbessert Erhaltung des Kohlenstoff-Film. Es muss in der Vorbereitung und Abwicklung der Netze getroffen werden, zB Bruch der empfindlichen Carbon Folie verhindert Probe Haftung und kann in eine ungenaue Darstellung der Probe führen. Während traditionell größere Probenvolumina von 5 ul wurden und werden routinemäßig für die Grid-Herstellung verwendet werden, können wertvolle Proben durch die Reduzierung der Lautstärke um 2 ul oder weniger 2 gespeichert werden.
- Zur Herstellung der größtmöglichen Membranen erfordern einige unserer Proben hohe Konzentrationen von Glycerin oder Saccharose (10-20%) anwesend zu sein in der Dialyse-Puffer. Dies kann sich negativ auf die Grid-Erstellung, wie Glycerin oder Saccharose ist hochviskos und verhindert Uranylacetat aus richtig Eindringen in die Puffer, und damit unvollständig Färbung der Membranen. Folglich wird eine mögliche Gitter wird verdeckt werden. Entweder kann der Puffer durch Zentrifugation der Proben und Ersatz durch Glycerin / Saccharose-freiem Puffer (nicht dargestellt), oder die Netze ausgetauscht werden können mit Puffer oder Glycerin / Saccharose-freiem Puffer in einem bis zu mehreren Zyklen vor negativen Färbung ähnlich gewaschen werden eine Technik für die Kryo-EM 3,4 verwendet.
2. Die Beurteilung 2D-Kristallisation Trials durch EM
- Je nach Art des Probenhalters, sind entweder ein oder mehrere Gitter geladen. Eine Vergrößerung von 2-10K, die hier als Zwischenprodukt Vergrößerung bezeichnet werden, können für einen ersten Eindruck des durchschnittlichen Verteilung und den Umfang der Dispersion von Membranen, Morphologie und Größe, die Kenntnis der Laborjournal 5 aufgenommen ist. Geeignete Flächen sind als Vertreter Übersichten mit Hilfe einer CCD-Kamera aufgenommen oder, wenn eine CCD-Kamera zur Verfügung steht, auf dem Film.
- Geringer Vergrößerung im Bereich von etwa 400-800x ist manchmal verwendet, wenn ein Überblick über die gesamte Probe / grid gewünscht ist. Zwar nicht mit jedem Netz eingesetzt, gibt geringer Vergrößerung wertvolle Informationen helfen bei der Auswertung des Grid Vorbereitung im Hinblick auf mehrere Aspekte: sowohl negative Färbung und potenziellen teilweisen Bruch der Kohlenstoff-Film, Probe die Konzentration auf das Gitter, und möglicherweise ungleichmäßige Verteilung proteoliposome. Individuelle Planquadrate könnte mit dem Fernglas oder CCD-Kamera betrachtet werden. Mit einigen EMs ist es möglich, Positionen von besonderem Interesse, die für die spätere Inspektion bei höheren Vergrößerungen abgerufen werden retten können.
- Einmal im Netzgebiet von Interesse ist, und zwar geringe oder mittlere Vergrößerung identifiziert worden, ist die Vergrößerung auf ca. 50K-60K verändert. Je nach Membran, Kristall und Elementarzelle Größe, sofern bekannt, Vergrößerungen so niedrig wie 30K und so hoch wie 80K verwendet werden. Der Vergrößerungsbereich von 30-80K wird als hoher Vergrößerung für den Zweck des Screenings für 2D-Kristalle bezeichnet werden. Die Fokussierung erfolgt entweder in den Fokus Einstellung der low-dose-Setup, mit anschließender Umstellung auf Bild / Foto-Einstellung oder in der Nähe des Gebietes von Interesse.
- In Fällen von Mehrdeutigkeit in, ob der Bereich von Interesse ist in der Tat eine Membran, wird die Probe für die Kohlenstoff-Film in der Größe der Proteoliposomen, Glimmer oder andere Artefakte untersucht. Zu diesem Zweck zeigen Kanten typischen Falten und Morphologie.
- Jetzt den Bereich von Interesse ist mit einem CCD-Kamera inspiziert. Ein CCD-Bild wird in 30K-80K Vergrößerung gesammelt, je nach Größe Membran, Protein-oder Elementarzelle Größe oder bekannten kristallinen Bereich. Der Verband der kleineren und / oder überwiegend hydrophobe Membran-Protein ist nicht unbedingt sichtbar durch visuelle Beurteilung der CCD selbst. Entweder das gesamte Bild ist für eine Online-Fourier-Transformation (FT, oder schnelle FT-FFT) eingesetzt. Das FT enthält eine erhebliche Menge an Lärm, aber wenn die bestellte Array ist klein. So wird eine reduzierte boxed Bildgröße für ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis eines smal ermöglichenler Kristall und leichteren Identifizierung. Zu diesem Zweck wird die Box über das Bild bewegen und eine Live-FT ausgewertet wird.
Die Intensität / Helligkeit der Strahl so eingestellt halten low-dose Bedingungen für die Probe sowie CCD-Kamera-Einstellungen im Blick. Abhängig von der CCD-Kamera verwendet wird, ist das Gamma des Live-FT für eine optimale Identifizierung der bestellten Arrays angepasst. Eine zu hohe Wert kann obskuren Flecken durch Lärm Beiträge und eine zu niedrige Gamma-Wert wird schwächer Spots aus identifiziert zu verhindern. Diese schwache Flecken könnte durch kleinere kristalline Arrays mit Spots in der FT knapp über den Geräuschpegel.
Während die Daten in einer höheren Auflösung hat sich von einer kleinen Anzahl von Proben 6 gesammelt wurden, ist häufig die Auflösung von negativ gefärbten 2D-Kristalle beschränkt oder sollte nicht zu erwarten, besser zu sein als etwa 15a Auflösung. Mit einem von ca. -400 nm defocus, nicht mehr als 1-3 Bestellungen von Spots sollen leicht identifiziert werden. Die Proben werden in der Regel nicht für die Auflösung ausgewertet, wie Kryo-EM-Datenerhebung wird eine korrekte Angabe der höchste erreichbare Auflösung geben. Schärfe der Spots und mögliche Mosaizität sind zwar zur Kenntnis genommen.
- Unterschiedliche Membranen sowie Membran Morphologien sind für Ordnung bei hoher Vergrößerung ausgewertet. Dies ist besonders kritisch zu Beginn oder Zwischenstufen von 2D-Kristallisation Studien als eher kleiner als größer Proteoliposomen oder Membranflecken der vielversprechendsten Bereiche enthalten kann. Sehr geringe Anteile der 2D-Kristalle benötigen Bildaufnahme und FT, oder optische Beugung, der eine große Anzahl von Bildern seit der erstmaligen Ermittlung der geordneten Strukturen häufig auf eine rasche Verbesserung der Größe und Qualität 2,4,7 führen wird.
3. Repräsentative Ergebnisse
Idealerweise bestellt Proteoliposomen Display leicht erkennbar, scharfe Flecken. Große und gut geordneten Kristalle sind leicht durch Online-FT von CCD-Aufnahmen oder optische Beugung von Aufnahmen identifiziert.
Das Beispiel zeigt, 2D-Kristalle von einer kleinen Membran-Protein von 18kDa, die bis zu mehrere Mikrometer groß. Spots auf dem FT sind leicht zu erkennen und scharf. Die Bewegung der Live-FT-Box zeigt, dass das Gitter kontinuierlich ohne Mosaizität ist. Das Gitter eines größeren Proteins mit einer umfangreicheren löslichen Domäne kann auf dem kleinen Bildschirm des EM identifiziert werden. CCD-Sammlung und FT ist notwendig, um ein Mittel zur besseren Einschätzung geben und Informationen über zB möglich Mosaizität (zeige FT) zu gewinnen. Bei der Berechnung eines FT eines proteoliposome, die nicht bestellt ist, können Geräusche zunächst für Flecken verwechselt werden. Während das Feld für die Live-FT verschoben wird, jedoch werden die Flecken verschwinden. Auf der anderen Seite, kleine Arrays, mit fragwürdigen Kristallinität, haben ihre Plätze stationär bleibt, wenn die Live-FT sogar leicht über dem Bild bewegt. Darüber hinaus können diese kleinen Kristalle durch in der Regel mit der gleichen Einheit Zellgrößen anerkannt zu werden, und Entfernungen zwischen den Spots in verschiedenen FTs kann auf verschiedene Weise, wie mit einem Kreis von einer bestimmten Größe gemessen werden. Lipid-Kristalle zeigen eine deutliche Gitterstruktur Morphologie und FT.
Es ist nicht ungewöhnlich, dass Niederschläge in ersten Versuchen begegnen. Hier Proteinfällung ohne Rekonstitution Bedürfnisse von kleinen Lipidaggregate aber unterschieden werden. Die Proben, die bei geringer Vergrößerung werden Ausscheidungen erscheinen häufig entpuppen sich Lipidaggregate werden, wenn bei höherer Vergrößerung betrachtet. Nach Inspektion bei 30-50K, zeigen die Ränder dieser dunklen Strukturen sie von Membranen ohne Fällung des Proteins zusammengesetzt sein. Dies sind wichtige Beobachtungen wie die Lipid-Aggregate können in der Größe zu großen Membranen in den folgenden Experimenten erhöht werden.
Schlechte Ergebnisse bei der Auswertung Proben werden manchmal auf eine niedrige Membran-Konzentration, die richtige und schnelle Screening verhindert verbunden. Dies kann häufig mit der Verwendung einer höheren Protein-Konzentration für 2D-Kristallisation durch Dialyse überwunden werden. Alternativ können die Eihülle verlassen, um für ein paar Tage an der Unterseite der Eppendorf-Röhrchen während der Lagerung zu begleichen. In einigen Fällen schneller, oder fast sofortige Absetzen von Membranen erfolgt und Pipettieren aus dem Boden des Röhrchens wird in einer höheren Dichte Membran auf das Gitter führen. Ein weiterer viel schneller Option Zentrifugation (bei 3000-8000 Umdrehungen pro Minute für 1-3 Minuten) von Proben mit anschließender Entnahme aus dem Boden des Röhrchens.
Die Proben unter optimalen Bedingungen enthält einen großen Prozentsatz von 2D-Kristallen. Es ist nicht notwendig, für ein homogenes Erscheinungsbild von Membranen Ziel, als das größte und gut geordneten 2D-Kristalle sind optisch für Daten ausgewählte Sammlung. Diese Arten von Proben werden leicht erkannt werden, wenn die Kristallisation Studien als auch bei den Proben für die verwendet werden, sind wiederholtKryo-EM-Datenerfassung, was zu einer maximalen Anzahl von hochauflösenden Bildern.
Abbildung 1. Diese Abbildung zeigt Blotting den Rand des Gitters mit einem zerrissenen Stück Whatman Nr. 4 Filterpapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proper Auswertung von Proben erfordert eine sorgfältige Beurteilung einer ausreichenden Anzahl von Membranen. Zum Beispiel gab Proben mit so niedrig wie 2% kristallinen Arrays aus über 180 abgebildet Proteoliposomen wichtige Informationen für die schnelle Optimierung von 2D-Kristallisation Bedingungen 7.
Wenn Fällung des Proteins auftritt, könnte ein Gitter von der weiteren Screening nach der Inspektion bei geringer Vergrößerung aufgegeben werden, obwohl gelegentliche partielle Fällung von Protein auftritt. Selbst sehr kleine Membranen von weniger als 100 nm können hilfreiche Informationen über Um aber zu geben, und Parameter, um die 2D-Kristall Größe zunehmen kann in den folgenden Dialyse Experimente umgesetzt werden.
Laboratories sind in den Prozess der Einführung verschiedene Grade der vielversprechenden Automatisierung in den Prozess der Screening 8,9. Doch Proben werden noch benötigt Schritte der Bewertung und die Kenntnis der 2D-Kristall Größe, Morphologie und Ordnung, wie hier beschrieben. In Zukunft könnte es möglich sein, Daten von immer kleineren 2D-Kristallen um eine höhere Auflösung zu analysieren, so dass diese Screening-Schritte und desto schwieriger Auswertung der kleineren kristallinen Bereiche noch kritischer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wir danken unseren Mitarbeitern für die wertvolle Protein-Proben, die einige unserer Methoden bezogenen Erfahrungen und Beobachtungen beigetragen. Günther Schmalzing freundlicherweise die Möglichkeit, FR, dieses Projekt beizutreten. Barbara Armbruster, Jacob Brink und Deryck Mills sind bekannt für ihre hervorragende Hilfe und Eingang am Gerät dankte. Die Finanzierung wurde von NIH HL090630 zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | |||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | ||
| Micropipette and pipette tips | |||
| Whatman #4 filter paper | |||
| 1% uranyl acetate | |||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | |||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | ||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
References
- Johansen, B. V. Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage. Micron. 7, 145-156 (1976).
- Schmidt-Krey, I. Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy. Methods. 41, 417-426 (2007).
- Wang, D. N., Kühlbrandt, W. High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media. J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).
- Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles. Micron. , (2010).
- Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., Kühlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent γ-glutamyl carboxylase. J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).
- Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 Å resolution. J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).
- Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters. J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).
- Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. Towards automated screening of two-dimensional crystals. J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).
- Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).
