Summary
주문한 막 단백질 배열의 형성을위한 2 차원 (2D) 결정화 실험을 평가하는 것은 전자 crystallography에 매우 중요하고 어려운 작업입니다. 90kDa - 여기에 대한 심사와 15의 범위에서 주로 작은 막 단백질의 2D 결정을 식별하는 우리의 접근 방식을 설명합니다.
Abstract
전자 crystallography 중 하나 또는 또는 구조 기능 막 단백질의 질문에,뿐만 아니라 수용성 단백질을 연구 세 가지 차원 결정화 및 X - 선 crystallography와 함께 사용할 수있는 방법으로 진화했다. 전송 전자 현미경에 의해 2 차원 (2D) 결정에 대한 심사는 (EM) 최적화, 그리고 cryo - EM하여 고해상도 데이터 수집에 대한 샘플을 선택 찾는 중요한 단계입니다. 여기 우리는 잠재적으로 결정화 조건의 최적화에 대한 중요한 정보를 제공 수, 대형 및 주문뿐만 아니라, 작은 2D 배열을 모두 식별에 근본적인 단계를 설명합니다.
EM에서 서로 다른 배율과 협력함으로써, 중요한 매개 변수의 범위에있는 데이터가 얻어진다. 낮은 배율은 형태학 및 멤브레인 크기에 귀중한 자료를 제공합니다. 높은 배율에서 가능한 순서 및 2D 크리스탈 크기가 결정됩니다. 이러한 맥락에서, 그것은 CCD 카메라와 온라인 푸리에 변환이 순서와 크기 proteoliposomes을 평가하기 위해 더 높은 배율에서 사용하는 방법에 설명되어 있습니다.
막 단백질의 2D 결정이 가장 일반적으로 투석에 의해 reconstitution에 의해 성장하는 동안, 심사 기술 monolayers, 기본 차원 결정의 도움으로 제작 결정에 동일하게 적용되며, 수용성 단백질의 배열을 명령했다. 또한, 여기에서 설명한 방법 작은 단백질이 큰 단백질 우리의 예제와 격자로 식별에있는 치료의 동일한 금액을 요구에도 소규모의 2D 결정뿐만 아니라 큰 멤브레인 단백질에 대한 심사에 적용되는 더 쉽게 식별할 수있을 심사의 이전 단계에서.
Protocol
1. 2D 결정화 재판의 그리드 준비
- 탄소 코팅 400 메쉬 구리 EM 격자는 부정적인 얼룩으로 준비하고 있습니다. Uranyl 아세테이트는 자주 사용 및 지속적인 격자의 장기 저장을 위해 사용뿐만 아니라 적합성 전에 몇 달 동안 솔루션의 저장 용량 측면에서 얼룩을 제공합니다. 반면, 같은 uranyl의 편대와 같은 다른 부정 얼룩, 우수한 얼룩을 제공하면서는, 갓 1 만들었해야합니다. 2D 결정화 실험의 심사에 사용되는 격자의 다수의 빠른 준비, 부정적인 얼룩의 수정된 버전이 사용됩니다. 샘플 2 μL의 볼륨은 탄소 대상 EM 그리드에 pipetted 60 S.위한 incubated입니다 이것은 왓먼의 찢어진 조각 # 4 필터 용지 (그림 1, 비디오)와 가장자리에서 모래 바닥을 따라, 그리고 1 % uranyl 아세테이트 2 μL를 즉시 적용되고있는 다시 30 후 격자의 가장자리에서 blotted 아르 S. 필터 종이의 찢어진 가장자리와 가장자리에있는 격자를 감동하면 proteoliposomes 제거하지 않고 액체의 최적의 제거를 보장합니다. 또한, 그리드의 가장자리에 건조가 탄소 필름의 향상된 보존을 보장합니다. 섬세한 탄소 필름의 파손은 샘플 접착을 방지하고 샘플의 부정 확한 표현이 발생할 수 있으므로주의가, 준비와 격자의 취급에 촬영해야합니다. 5 μL의 전통적으로 큰 샘플 볼륨이되었고 정기적으로 그리드 준비에 사용되는 반면, 소중한 샘플 2 μL 또는 2 이하로 볼륨을 감소시켜 저장할 수 있습니다.
- 가장 큰 가능한 세포막을 생산하기 위해, 우리의 샘플 중 일부는 글리세롤이나 자당 높은 농도 (10~20%)는 투석 버퍼에 존재해야합니다. 글리세롤이나 자당이 높은 점성이고 제대로 버퍼를 관통하고, 따라서 불완전 세포막을 얼룩으로부터 uranyl 아세트산을 방지로 이것은 그리드의 준비에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 가능한 격자가 드러나지 않습니다. 어느 버퍼가 글리세롤 / 자당 무료 버퍼 (표시되지 않음), 또는 격자의 샘플 및 교체의 원심 분리에 의해 교환 수가와 유사한 부정적인 얼룩 전에 몇주기 버퍼 또는 하나의 글리세롤 / 자당 무료 버퍼로 씻어 수 있습니다 cryo - EM 3,4에 사용되는 기술.
2. EM으로 2D 결정화 평가판을 평가
- 샘플 홀더의 유형에 따라 하나 또는 여러 개의 격자 중 하나가로드됩니다. 중간 배율로 여기라고한다 2 - 10K의 확대는 실험실 노트북 5주의 촬영입니다 세포막, 형태, 및 크기의 분산의 평균 유통 및 범위의 첫 인상에 대한 수 있습니다. CCD 카메라는 필름에 사용할 수없는 경우 적합 영역, CCD 카메라의 도움으로 대표 개요로 기록 또는 있습니다.
- 샘플 / 그리드 전체의 개요가 원하는 경우 약 400 800x의 범위에서 낮은 배율은 시간에 사용됩니다. 모든 그리드와 고용 없지만, 낮은 배율은 여러 측면 측면에서 그리드 준비의 평가에 도움이 귀중한 정보를 제공합니다 : 부정 얼룩 및 탄소 필름, 그리드에서 샘플 농도, 그리고 아마도 고르지 proteoliposome 배포판의 가능성이 일부 파손 모두. 개인 그리드 사각형은 쌍안경이나 CCD 카메라로 볼 수 있습니다. 일부 EMS과 함께 더 높은 배율에서 나중에 검사에 대한 리콜 수있는 특정 관심의 위치를 저장 할 수 있습니다.
- 관심 그리드 영역 중 낮은 또는 중간 배율에서 확인되었습니다되면, 배율은 약 50K - 60K로 변경됩니다. 알려진 경우 30K로 낮은 80K처럼 높은 배율은, 멤브레인, 크리스탈과 단위 셀 크기에 따라 것은 사용됩니다. 30 - 80K의 배율 범위는 2D 결정에 대한 심사의 목적은 높은 배율로 불리는 것입니다. 포커싱 이미지 / 사진 설정하거나, 관심있는 지역의 주변에 이후의 스위치와 함께, 낮은 복용량 설정의 초점 설정에서 하나 발생합니다.
- 관심 분야가 실제로 막 여부에 모호함의 경우, 샘플 proteoliposomes, 운모, 또는 기타 유물의 크기 탄소 필름 검사입니다. 이러한 목적으로, 가장자리는 전형적인 접는 조직 형태를 공개.
- 이제 관심의 영역은 CCD 카메라와 함께 검사합니다. CCD 이미지는 막의 크기, 단백질 또는 단위 셀 크기에 따라 30K - 80K 확대 수집하거나, 결정 영역을 알려져 있습니다. 작은 및 / 또는 대부분 소수성 막 단백질의 격자는 CCD 이미지 자체의 시각적 평가에 의해 반드시 표시되지 않습니다. 어느 전체 이미지가 온라인 푸리에 변환 (FT, 또는 빠른 FT - FFT)에 사용됩니다. 주문 배열 작은 경우이 FT는 그러나, 소음들을 상당히 포함됩니다. 따라서, 감소 박스 이미지 크기는 smal의 향상된 신호 대 잡음 비율에 대한 수ler 크리스탈 쉽게 식별. 이러한 목적으로, 상자는 이미지를 통해 이동하고 라이브 FT는 평가입니다.
빔의 강도 / 밝기는 낮은 복용량 샘플 조건뿐만 아니라, 마음에 CCD 카메라 설정을 유지 조정됩니다. 사용 CCD 카메라에 따라 살아있는 FT의 감마는 주문한 배열의 최적의 식별을 위해 조정됩니다. 지나치게 높은 값을 소음 공헌으로 인해 장소를 가리 수 있고, 지나치게 낮은 감마 값을 식별되는 약한 장소를 방지할 수 있습니다. 이러한 약한 명소 거의 소음 수준 위의 FT의 명소로 작은 결정 배열에 의한 것입니다.
높은 해상도에서 데이터가 샘플 6 소수의 수집되어 있지만, 부정적인 스테인드 차원 결정의 일반적으로 해상도가 제한되거나 약 15A 해상도보다 나은 것으로 예상해서는 안됩니다. 약 -400 NM의 defocus 아니라 함께 명소 이상의 1-3 명령은 쉽게 식별 것으로 예상된다. 샘플은 일반적으로 cryo - EM 데이터 수집이 최고 달성 해상도의 적절한 표시를 줄 것이다로서, 해상도에 대해 평가하지 않습니다. 장소 가능한 mosaicity의 선명도는하지만 설명되어 있습니다.
- 다른 세포막뿐만 아니라 멤브레인 morphologies은 높은 배율에서 주문 평가하고 있습니다. 작은보다 큰 proteoliposomes 또는 막 패치가 가장 유망한 분야를 포함할 수 있듯이, 시작 또는 2D 결정화 실험의 중간 단계에 특히 중요합니다. 2D 결정의 매우 낮은 비율은 주문한 배열의 초기 식별이 자주 크기와 품질 2,4,7의 급속한 발전으로 이어질 것입니다 때문에 이미지의 다수의 이미지 수집 및 FT, 또는 광학 회절을 필요합니다.
3. 대표 결과
이상적으로 주문 proteoliposomes가 쉽게 알아볼, 날카로운 명소를 표시합니다. 대형 잘 명령 결정을 쉽게 CCD 이미지 또는 micrographs의 광학 회절의 온라인 FT에 의해 식별됩니다.
예를 들어 크기가 몇 미크론까지 아르 18kDa의 작은 막 단백질의 2D 수정을 보여줍니다. FT에 얼룩이 쉽게 식별하고 날카로운 있습니다. 라이브 - FT 상자의 움직임은 격자가 mosaicity없이 지속 것을 보여줍니다. 보다 광범위한 가용성 도메인과 큰 단백질의 격자는 EM의 작은 화면에서 확인할 수 있습니다. CCD 이미지 수집 및 FT 더 나은 평가 수단을 제공하고, 예를 들어, 가능한 mosaicity (쇼 FT)에 대한 정보를 얻을 필요가 있습니다. 주문되지 않은 proteoliposome의 FT을 계산할 때, 소음이 처음 장소에 대한 오해하실 수 있습니다. 라이브 FT에 대한 상자가 이동하는 동안 그러나, 반점이 사라집니다. 반면에, 작은 배열, 의심 결정화와 라이브 FT는 이미지 영역도 약간 이동하면 고정 남아있는 그들의 반점을 가지고 있습니다. 또한, 이러한 작은 결정은 일반적으로 동일한 단위 셀 크기를 가지고 인식 될 수 있으며, 다른 FTs의 명소 간의 거리는 특정 크기의 원형과 같은 다양한 방법으로 측정할 수 있습니다. 지질 결정은 별개의 격자 형태와 FT를 표시합니다.
그것은 초기 실험에서 강수량이 발생하는 일반적입니다. reconstitution없이 여기 단백질 강수량하지만 작은 지질 집계에서 구별해야합니다. 낮은 배율에서 precipitates 것으로 나타날 샘플 자주 높은 배율에서 볼 때 지질 집계로 판명. 30 - 50K에서 검사시 이러한 어두운 구조의 가장자리 그들은 단백질없이 강수량과 세포막의 구성을 밝혀. 지질 집계는 다음 실험에 큰 세포막 크기의 증가 수도 있습니다 이러한 중요한 관찰합니다.
평가 샘플에서 가난한 결과는 때로는 적절한 빠른 검사을 방지 낮은 멤브레인 농도에 연결되어 있습니다. 이것은 자주 투석에 의해 2D 결정에 대한 높은 단백질 농도를 사용하여 극복할 수 있습니다. 또는 안정이 저장되는 동안 Eppendorf 튜브의 하단에 며칠 동안 정착에 남아있을 수 있습니다. 어떤 경우에는 세포막의 신속, 또는 거의 인스턴트 정착이 발생하여 튜브 바닥에서 pipetting하면 그리드에서 높은 막 밀도가 높아집니다. 또 다른 훨씬 빠른 방법은 튜브의 바닥에서 이후의 샘플링과 샘플 원심 분리 (1~3분에 대한 3000-8000 rpm으로)입니다.
최적의 조건 하에서 샘플은 2D 결정의 큰 비율을 포함합니다. 그것은 가장 크고 가장 잘 주문한 2D 결정이 데이터에 대한 시각이 선택되어 모음으로, 점막의 균일한 모양 목표 필요가 없습니다. 결정화 실험이뿐만 아니라 샘플을 사용하는 경우 반복하는 경우 샘플을 이런 종류의 쉽게 인식됩니다고해상도 이미지의 최대 개수에 결과 cryo - EM 데이터 수집.
그림 1.이 그림은 왓먼의 찢어진 조각 # 4 필터 종이 그리드의 가장자리를 모래 바닥 보여줍니다.
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Discussion
샘플 적절한 평가는 세포막의 충분한 숫자의 신중 평가가 필요합니다. 예를 들어, 180여 군데 proteoliposomes 밖으로 낮은 % 2로 결정 배열 샘플 2D 결정화 조건 7 빠르고 최적화에 대한 중요한 정보를했다.
단백질의 일부 가끔 침전이 발생하지만, 단백질의 침전이 발생하면, 그리드는 낮은 배율에서 검사 후 추가 검사에서 버려진 수 있습니다. 100 개 미만 NM의 비록 아주 작은 점막하지만 주문에 대한 유용한 정보를 줄 수 있으며 2D 크리스탈 크기를 증가 매개 변수는 다음과 투석 실험에서 구현할 수 있습니다.
실험실 검사 8,9의 과정으로 유망 자동화의 다양한 학위를 도입하는 과정에 있습니다. 여기에 명시된 바와 같이 아직 샘플은 여전히 2D 크리스탈 크기, 형태, 및 순서의 평가 및 지식의 단계가 필요합니다. 앞으로는 이러한 심사 단계 및 더욱 중요한 작은 결정 영역의 더 어려운 평가를하고, 높은 해상도로 점점 작은 2D 결정의 데이터를 분석하는 것이 가능이 될 수도 있습니다.
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Acknowledgments
우리는 우리의 방법과 관련된 경험과 관찰의 일부에 기여 귀중한 단백질 샘플을 제공하는 우리의 공동 작업자를 주셔서 감사합니다. 군터 Schmalzing은 친절이 프로젝트에 참여 FR 수있는 기회를 제공했습니다. 바바라 암브러스터, 야곱 브링크 및 Deryck 밀스가 자신의 뛰어난 도움말 및 장비에 대한 입력을위한 감사합니다. 기금은 NIH 부여 HL090630에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | |||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | ||
| Micropipette and pipette tips | |||
| Whatman #4 filter paper | |||
| 1% uranyl acetate | |||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | |||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | ||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
References
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