Summary
Elektron kristalografisi sipariş membran protein dizileri oluşumu için iki boyutlu (2D) kristalizasyon çalışmalarda değerlendirilmesi son derece kritik ve zor bir iştir. 90kDa - Burada tarama ve 15 aralığında ağırlıklı olarak küçük membran proteinlerinin 2D kristalleri tespit yaklaşım tarif.
Abstract
Elektron kristalografisi, ya alternatif olarak veya membran proteinlerinin yapı-işlev sorular, eriyen proteinlerin yanı sıra çalışma, üç boyutlu kristalizasyon ve X-ışını kristalografisi birlikte kullanılabilecek bir yöntem olarak gelişti. Transmisyon elektron mikroskobu ile iki boyutlu (2D) kristalleri için tarama (EM) optimize ve cryo-EM tarafından yüksek çözünürlüklü veri toplama için örnekler seçerek bulma kritik bir adımdır. Burada potansiyel kristalizasyon koşullarının optimizasyonu için kritik bilgi kaynağı olabilir, büyük ve sipariş yanı sıra küçük 2D dizileri belirlenmesinde temel adımları açıklar.
EM farklı büyütme ile çalışarak, bir dizi kritik parametreleri veri elde edilir. Alt büyütme, morfolojisi ve membran boyutu değerli veri sağlamaktadır. Yüksek büyütmeler, düzen ve 2D kristal boyutları belirlenir. Bu bağlamda, yüksek büyütmelerde kullanılan CCD kamera ve online-Fourier Dönüşümleri düzen ve boyutu için proteoliposomes değerlendirmek için nasıl tarif edilir.
Membran proteinlerinin 2D kristalleri diyaliz ile sulandırıldıktan en yaygın olarak yetiştirilen, tarama tekniği, mono tabakaları, yerli 2D kristaller yardımıyla üretilen kristal için de geçerlidir ve çözünür proteinler dizileri emretti. Buna ek olarak, burada açıklanan yöntemleri büyük proteinler ve bizim örnek ve kafes gibi küçük proteinlerin belirlenmesinde aynı miktarda bakım gerektiren daha küçük 2D kristalleri gibi büyük membran proteinleri, tarama daha kolay tanımlanabilir olabilir tarama önceki aşamada.
Protocol
1. 2B Kristalizasyon Denemeler Izgara Hazırlama
- Karbon-400-mesh kaplı bakır EM ızgaraları negatif leke tarafından hazırlanmıştır. Uranil asetat sık kullanılan ve ızgaraları uzun süreli depolama için kullanımının yanı sıra uygunluğu önce birkaç ay boyunca uzun süreli bir çözüm depolama açısından leke sağlar. Buna karşılık, uranil format gibi diğer olumsuz lekeleri, mükemmel boyama sağlarken, taze 1 yapılabilir. Izgaraları 2D kristalizasyon çalışmaların tarama için kullanılmak üzere çok sayıda hızlı bir şekilde hazırlanması için, negatif boyama değiştirilmiş bir versiyonu kullanılmıştır. 2 mcL örnek hacmi, bir karbon kaplı EM ızgara üzerine pipetlenebilir ve 60 saniye süreyle inkübe Bu whatman bir yırtık parça # 4 filtre kağıdı (Şekil 1; video) kenarından blot takip eder ve daha sonra% 1'lik uranil asetat 2 mcL hemen uygulanır, 30 sonra tekrar ızgara kenarından kurutulur s Filtre kağıdı yırtılmış kenarı ile jant üzerinde grid dokunmak proteoliposomes kaldırılması olmadan sıvı optimal çıkarılması sağlar. Ayrıca, ızgara kenarında kurutma, karbon film geliştirilmiş koruma sağlar. Hassas karbon film kırılması örnek yapışmayı önler ve örnek bir yanlış temsili neden olabilir Bakım, hazırlama ve ızgaraları işleme alınması gerekir. 5 mcL geleneksel büyük örnek hacmi ve ızgara hazırlanması için rutin olarak kullanılan iken, değerli örnekleri 2 mcL veya daha az 2 hacmi azaltarak kaydedilebilir .
- Mümkün olan en yüksek membranlar üretmek için, bazı örneklerin gliserol veya sukroz, yüksek konsantrasyonlarda (% 10-20), diyaliz tampon mevcut olması gerekir. Gliserol veya sukroz, yüksek viskoz ve uranil asetat tampon düzgün bir nüfuz ve böylece eksik membranlar boyama engeller, ızgara hazırlanması üzerinde olumsuz bir etkisi olabilir. Dolayısıyla olası bir kafes gizlenmiş olacaktır. Ya tampon, gliserol / sakaroz-tampon (gösterilmemiştir), veya ızgaraları ve yedek örnekleri santrifüj ile değiş tokuş edilebilir benzer negatif boyanma önce birkaç döngüleri tampon ya da tek bir gliserol / sakaroz ücretsiz tampon yıkanabilir cryo-EM 3,4 için kullanılan bir tekniktir.
2. EM 2D Kristalizasyon Denemeler Değerlendirilmesi
- Numune sahibinin türüne bağlı olarak, bir veya birden fazla ızgaraları ya yüklenir. Burada ara büyütme sevk edilecektir 2-10K, büyütme, laboratuvar dizüstü 5 not alınır membranlar, morfolojisi ve büyüklüğü, dağılımı ortalama dağılımı ve kapsamı bir ilk izlenim sağlar. CCD kamera, film üzerinde mevcut değilse, uygun alanlarda bir CCD kamera yardımıyla temsili Özetler olarak kaydedilir veya.
- Tüm örnek / ızgara bir bakış istendiğinde kabaca 400-800x aralığında düşük büyütme, zaman zaman kullanılır. Her ızgara ile istihdam olmasa da, düşük büyütme ızgara hazırlık çeşitli yönleri açısından değerlendirilmesinde yardımcı değerli bilgiler verir: negatif boyama ve karbon film, ızgara üzerinde örnek konsantrasyon, ve muhtemelen düzensiz proteoliposome dağıtım potansiyel kısmi kırılması. Bireysel ızgara kareler dürbün veya CCD kamera ile görüntülenebilir olabilir. Bazı sabahları yüksek büyütmelerde daha sonra muayene için geri çağrılabilir ve özellikle ilgi çekici pozisyonları, kaydetmek mümkündür.
- Ilgi ızgara alanı, ya düşük veya orta büyütme tespit edildikten sonra, büyütme yaklaşık 50K-60k değiştirildi. 30K olarak düşük ve 80K gibi yüksek büyütmeler, eğer biliniyorsa, membran, kristal ve birim hücre boyutuna bağlı olarak kullanılır. 30-80K büyütme aralığı 2D kristalleri için tarama amacıyla yüksek büyütme olarak sevk edilecektir. Odaklama, resim / fotoğraf ayarı, ya da ilgi alanı çevresinde sonraki anahtarı ile odak ayarı düşük doz set-up ya da oluşur.
- Gerçekten bir zar ilgi alanı olup olmadığını belirsizlik durumlarında, örnek proteoliposomes, mika, ya da diğer eserler büyüklüğü, karbon film için denetlenir. Bu amaçla, kenarlar tipik bir katlama ve morfoloji ortaya koymaktadır.
- Şimdi ilgi alanında bir CCD kamera ile denetlenir. CCD görüntü 30K-80K büyütme toplanan membran boyutu, protein veya birim hücre boyutunu bağlı olarak, ya da kristal alan bilinmektedir. Küçük ve / veya çoğunlukla hidrofobik membran proteini kafes CCD görüntü kendisi görsel değerlendirme mutlaka görünmez. Ya görüntünün tamamını online Fourier dönüşümü (FT, ya da hızlı FT-FFT) kullanılır. Bu FT sipariş dizi küçük ise, ancak önemli bir miktar gürültü içerecektir. Böylece, bir simgesi ve gelişmiş bir sinyal-gürültü oranı düşük bir kutulu görüntü boyutu için izin verecekler kristal ve kolay tanımlama. Bu amaçla, kutu resmin üzerine taşınır ve canlı bir FT değerlendirilir.
Kiriş / parlaklık yoğunluğu düşük doz örnek için koşulların yanı sıra akılda CCD kamera ayarları tutmak ayarlanır. Kullanılan CCD kamera bağlı olarak, canlı FT gama sipariş dizilerin en iyi tanımlanması için ayarlanır. Aşırı yüksek bir değer gürültü katkıları nedeniyle noktalar belirsiz olabilir ve aşırı derecede düşük bir gama değeri zayıf noktalar tespit ediliyor önleyecektir. Bu zayıf noktalar, ancak gürültü seviyesinden FT noktalar ile küçük kristal dizileri nedeniyle olabilir.
Örnekleri 6, az sayıda yüksek çözünürlükte veri toplanmış olsa da, olumsuz lekeli 2D kristalleri yaygın çözünürlük ile sınırlı ya da kabaca 15A çözünürlük daha iyi olması beklenmemelidir. Ile yaklaşık -400 nm bulanıklaştırma, lekeler fazla 1-3 siparişleri kolayca tanınabilir olması bekleniyor. Örnekleri cryo-EM veri toplama, en ulaşılabilir çözünürlüğü uygun bir göstergesi olarak, genellikle çözümü için değerlendirilir değildir. Noktalar ve olası mosaicity Netlik olsa belirtilmiştir.
- Farklı membranlar, membran morfolojileri yanı sıra, yüksek büyütme sipariş için değerlendirilir. Bu, küçük değil, büyük proteoliposomes veya membran yamaları en çok gelecek vaat eden alanlar içermesi gibi, başında veya 2D kristalizasyon çalışmaların ara aşamadan özellikle kritik. 2B kristalleri çok düşük yüzdeler sipariş dizilerin ilk kimlik boyutu ve kalitesi 2,4,7 hızlı bir gelişme sık sık neden bu görüntülerin çok sayıda görüntü elde etme ve FT, ya da optik kırınım, gerektirecektir .
3. Temsilcisi Sonuçlar
İdeal sipariş proteoliposomes kolayca tanınabilir, keskin noktalar gösterir. Geniş ve iyi düzenlenmiş kristaller kolayca CCD görüntü veya mikrograflar optik kırınım online-FT tarafından tespit edilir.
Örneğin, küçük boyutta birkaç mikron kadar 18kDa bir membran proteini 2D kristalleri gösterir. FT lekeler kolaylıkla tespit ve keskindir. Canlı FT kutusu hareket kafes mosaicity olmadan sürekli olduğunu gösterir. EM küçük ekran, daha geniş bir çözünür etki alanı ile daha büyük bir protein kafes tespit edilebilir. CCD görüntü toplama ve FT, daha iyi değerlendirilmesi için bir araç sağlamak ve, örneğin, mümkün mosaicity (gösterisi FT) hakkında bilgi elde etmek için gerekli. Sıralı olmayan bir proteoliposome FT hesaplanırken, gürültü başlangıçta noktalar için yanlış olabilir. Canlı-FT kutu hareket olmasına rağmen, ancak, lekeler kaybolur. Öte yandan, küçük diziler, şüpheli kristallik, canlı-FT hatta biraz görüntü alana taşındığında sabit kalan noktalar olacaktır. Ayrıca, bu küçük kristaller, genellikle aynı birim hücre boyutları olan tarafından kabul edilebilir ve farklı FTS noktalar arasındaki mesafeler, belirli bir büyüklükte bir daire gibi çeşitli şekillerde ölçülebilir. Lipid kristaller ayrı bir kafes morfolojisi ve FT gösterir.
Ilk çalışmalarda yağış karşılaşmak nadir değildir. Sulandırıldıktan olmadan protein yağış olsa küçük lipid agrega ayırt edilmesi gerekiyor. Düşük büyütmede çökeltileri olarak görünür Örnekleri sık sık yüksek büyütmede bakıldığında lipid agrega çıkıyor. 30-50K inceleme üzerine, bu karanlık yapıların köşeleri, onları hiç yağış protein ile membran oluşur ortaya koymaktadır. Aşağıdaki deneyler büyük zarlarında lipid agrega boyutu artmış olabileceği gibi, bu önemli gözlemler.
Değerlendirirken örnekleri Kötü sonuçlar bazen doğru ve hızlı bir tarama önleyen düşük bir membran konsantrasyonuna bağlı. Bu durum sıklıkla diyaliz ile 2B kristalizasyon için yüksek protein konsantrasyonu kullanımı ile aşılabilir. Alternatif olarak, membranlar Eppendorf tüp depolama sırasında alt kısmında bir kaç gün dinlenmeye bırakıldı. Bazı durumlarda membran hızlı, ya da neredeyse anında yerleştikten oluşur ve tüpün dibinden pipetleme ızgara daha yüksek bir membran yoğunluğu neden olacaktır. Çok daha hızlı bir başka seçenek tüp alttan sonraki örnekleme ile örneklerinin santrifüj (1-3 dakika 3000-8000 rpm).
Optimal koşullarda Örnekleri 2D kristallerinin büyük bir yüzdesini içerecektir. Bu en büyük ve en iyi sipariş 2D kristalleri veriler için görsel olarak seçilen topluluğu olarak, membran homojen bir görünüm için amacı gerekli değildir. Kristalizasyon denemeler gibi örnekler için kullanıldığı zaman tekrarlanan bu tür örnekleri kolayca tanınırmaksimum sayıda yüksek çözünürlüklü görüntüleri ile sonuçlanan cryo-EM veri toplama,.
Şekil 1: Bu rakam whatman # 4 filtre kağıdı yırtılmış bir parça ızgara kenar blot gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uygun değerlendirme örneklerinin membran yeterli sayıda dikkatli bir değerlendirme gerektirir. Örneğin, 180 üzerinden görüntülü proteoliposomes düşük% 2 olarak kristal dizileri örnekleri 2D kristalizasyon koşullarına hızlı optimizasyon 7 için kritik bilgi verdi.
Zaman zaman kısmi protein yağış görülse de, bir ızgara protein yağış oluştuğunda, düşük büyütmede incelemeden sonra, daha fazla tarama terk olabilir. Olsa bile çok az 100 nm küçük membranlar için hakkında yararlı bilgiler verebilir ve 2D kristal boyutunu artırmak için parametreler aşağıdaki diyaliz deneyler uygulanabilir.
Laboratuar 8,9 tarama süreci içine umut verici otomasyon çeşitli derecelerde tanıtan süreci. Ancak burada belirtildiği gibi örnekleri hala 2D kristal boyutu, morfolojisi ve düzeni değerlendirilmesi ve bilgi adımları gerektirir. Gelecekte, bu tarama adımları ve daha kritik küçük kristalin bölgelerde daha zor bir değerlendirme yapmak, daha yüksek çözünürlük için giderek daha küçük 2D kristallerin verileri analiz etmek mümkün hale gelebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz bazı yöntemleri ile ilgili deneyim ve gözlemler katkıda bulunan değerli protein örnekleri, sağlamak için bizimle işbirliği yapanlara teşekkür ediyorum. Günther Schmalzing lütfen bu projeye katılmaya FR için fırsat sağladı. Barbara Armbruster, Jacob Brink ve Deryck Mills olağanüstü yardım ve ekipman giriş için teşekkür. Finansman NIH hibe HL090630 tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | |||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | ||
| Micropipette and pipette tips | |||
| Whatman #4 filter paper | |||
| 1% uranyl acetate | |||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | |||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | ||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
References
- Johansen, B. V. Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage. Micron. 7, 145-156 (1976).
- Schmidt-Krey, I. Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy. Methods. 41, 417-426 (2007).
- Wang, D. N., Kühlbrandt, W. High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media. J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).
- Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles. Micron. , (2010).
- Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., Kühlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent γ-glutamyl carboxylase. J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).
- Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 Å resolution. J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).
- Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters. J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).
- Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. Towards automated screening of two-dimensional crystals. J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).
- Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).
