Kısmi ligasyon Fare Karotis Arter Disturbed Akış Kaynaklı Ateroskleroz ve Karotis Endotel RNA İzolasyonu Basit Bir Yöntem Bir Model

Summary

Bu fare karotis arter intraplak neo-vaskülarizasyon (dört hafta) ile rahatsız akış koşulları ve sonraki ateroskleroz gelişimi (iki hafta) neden olan bir kısmi karotis ligasyonu cerrahi, açıklamaktadır. Ayrıca, yüksek saflıkta endotel RNA, RNA izolasyonu, karotis intima yeni bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

Bilinen yakın ilişki olmasına rağmen, rahatsız akış aterogenez bağlayan doğrudan kanıt eksikliği olmuştur. Biz son zamanlarda, karotis kısmi ligasyonu yöntemleri değiştirilmiş bir versiyonu kullanılmıştır [1,2], akut fare karotis arterde düşük ve salınımlı akış koşulları, rahatsız akışının iki önemli özellikleri, uyardığı göstermek için. Bu modeli kullanarak, bozulmuş akışı gerçekten Apolipoprotein E nakavt fare [3] hızlı ve sağlam ateroskleroz gelişimine yol açtığı doğrudan kanıt sağladı. Ayrıca fare karotis intima [3], yüksek saflıkta endotel RNA hazırlık bir yöntem geliştirdi. Bu fare modeli ve yöntemi kullanarak, bu kısmi ligasyonu intraplak neovaskülarizasyon gibi kompleks lezyon oluşumu özellikleri ile dört hafta boyunca bir hiperlipidemik fare modeli iki hafta içinde sağlam ve hızlı bir aterom oluşumu takip, bir hafta içinde endotelyal disfonksiyon neden bulundu. Bu hızlı

Protocol

1. Kısmi sol karotis arter ligasyonu

1. Fare yaş ~ 8 hafta kullanılır. Farelerin ağırlığı en az 18 gram olması tavsiye edilir.
2. Boncuk enstrüman sterilizatör 30 saniyelik aletleri sterilize edin ve soğuması
3. Ketamin (80mg/kg) ve Xylazine (10mg/kg) intraperitoneal (ip) enjeksiyonu veya alternatif anestezi IACUC tarafından onaylanmış olarak anestezi neden. Ip enjeksiyon için, karın sol alt kadranda fare enjekte edilir.
4. Tamamen uyuşturuluyor kadar bir ısınma odası yerleştirin fare. Ayak tutam tepki ile anestezi derinliği olun.
5. Supin (karın tarafı yukarı) konumuna cerrahi bir sahnede Yeri fare. Teyp kadar ön patilerini avuç içi ve sahne aşağı arka pençeleri tek.
6. Mandibula ve sternum arasında boyun tüy dökücü ajan (örneğin Nair) liberal miktarda uygulayın. Yavaşça, masaj tüm saç çıkarılana kadar.
7. Tüy dökücü ajan temizleyin ve depilated bölgeye Betadine liberal miktarda uygulayın.
8. 6-0 ipek sütür ligasyonu için 1 inç uzun bölümler hazırlayın. Her fare iki adet dikiş gerekir.
9. , Keskin bir küçük makas kullanarak, boynun ortasında 4-6mm dikey bir kesi yapmak. Cilt ve altta yatan fasya kesilecek gerekir.
10. Orta hattan sola doğru hareket ettirin ve sol parotis bezi açık açık sadece sağ trakea diseksiyon başlar. Zonklayan sol karotis kolayca tespit etmek gerekir.
11. Kaudal karotis bifurkasyon buluncaya kadar izleyin.
12. Eksternal karotid arter, internal karotid arter, oksipital arter ve üstün tiroid arter, sol karotis arter kapalı aşağıdaki dört distal dallardan pervasızca açığa bifurkasyon teşrih. Bu gemiler, özellikle üstün tiroid, kırılgan olabilir. Diseksiyonu ile çok dikkatli olun.
13. 6-0 ipek sütür kullanarak üstün tiroid YUKARIDA eksternal karotid bağlayın. Bunu yapmak için, bir forseps arterin altından geçmek ve diğer forseps yardımı ile, önceden kesilmiş dikiş bir parça kapmak. Arterin altından geçmek için dikiş yavaşça çekin. Kravat sıkıca düğüm yakalanmış olmanın herhangi bir çevre doku kaçınarak. Etkili bir ölçüde farklı bir model tam bir ligasyonu gerçekleştirdik prosedürün sonuna kadar üstün tiroid arter altında kravat.
14. Internal karotid ve oksipital arterler aynı tekniği kullanarak bir düğümü ile bağlayın.
15. Sütür ve üstün tiroid arter açıklık konumu olun.
16. Doku Mend küçük bir miktar kullanarak yaklaşık cilt ve yakın cilt.
17. Kurtarma kadar bir ısınma odası yerleştirin fareler. Kurtarma genellikle 30 ila 60 dakika sürer.
18. Buprenorfin (0.1mg/kg) tek doz kullanılan anestezi, hayvanın ilk 24 saat içinde sıkıntı içinde ise, uzun süreli ağrı kesici (örn. inhalasyon izofluran) ya da eğer cerrahi sonrası hemen uygulanmalıdır. Deneyimlerimize göre, anestezi için uygulanan cerrahi, deneyimli bir cerrah tarafından yapılır ve daha fazla analjezi tabi Ketamin doz yeterli analjezi sağlar.

2. Karotis ultrason sınavı

1. Kısmi ligasyonu akışı rahatsız kaynaklı olmadığını doğrulamak için, karotis akışı, bir gün sonrası ligasyonu muayene edilmelidir
2. Izofluran ile anestezi neden gerekirse anestezi indüksiyonu kutusu olabilir
3. Kadar görüntüleme aşamasında, göbek yan anestezi fareler yerleştirin.
4. Görüntüleme sahnede EKG sensör Teyp kollar ve bacaklar
5. Nair liberal uygulama (zaten ligasyonu işlemi yapmadı eğer bu adımı sadece ihtiyaç vardır) boyun yapraksızlaştırmayı
6. Rektal termometre sıcaklığı kayıt takın
7. Boyun bölgesine uygulayın jel Echo
8. B-mod başlayın.
9. Görüntüleme düzlemine 90 derece olmalıdır (prob üzerindeki düğme fare burun doğru işaret etmelidir)
10. Görüntü elde edilir kadar fare boyun prob indirin.
11. Aşamada sol ve sağ trakea kadar (orta hat yapısı) tanımlanır işleyin
12. Sol karotis arter belirleyin
13. Tilt görüntüleme aşamasında bir açı ve karotid görüntüleme düzlemi arasında oluşturulur. Bu açının büyük, güçlü bir Doppler sinyali olacaktır.
14. Place nabız dalga Doppler sol karotis ortasında.
15. Açı düzeltme gerektiği şekilde kullanın.
16. Sağ karotis ölçümler tekrarlayın.
17. Başarılı kısmi karotis ligasyonu diyastolde aort girişine doğru akışının ters, sağ tarafı ile karşılaştırıldığında sol karotis akış genel bir azalma (~% 80-90) neden olacaktır.
18. Tatmin edici görüntüler elde edildikten sonra, anestezi kapatmak, fare ve ücretsiz fare off bant res jel yankı silintraints. Fareler ısındı kurtarma odasına yerleştirin.

3. Karotis gelen intimal RNA izolasyonu

1. Kurumsal IACUC protokole göre, _CO 2 inhalasyon fareler Kurban
2. Bir kağıt havlu Teyp pençeleri.
3. Karın, göğüs kafesinin üst farenin deri kesin.
4. Göğüs kafesinin altında keskin bir makas çifti ile karın duvarı açın.
5. Diyafram forseps ile sternum kaldırın ve kesmek, daha sonra göğüs kafesi kalp maruz kesip.
6. Vena kava makasla kesin.
7. Akciğer ve karaciğer soluk hale gelene kadar sol ventrikül içinde 10 adet / mL heparin içeren serum fizyolojik ile 2 ila 3 dakika süreyle basınç serpmek (120 mmHg).
8. Boyun deri kesin ve karotid arterlerin maruz kadar tüm yağ, kaslar ve bağ dokuları kaldırmak.
9. Diseksiyon mikroskobu altında fare yerleştirin.
10. Ponksiyon, ikinci perfüzyon için sol karotis ligasyonu siteleri hemen altında bir delik.
11. ~ Sol ventrikül ile sol karotis inceledi emin olun, 10 adet / mL heparin içeren serum fizyolojik ile 1 dakika için tekrar Basınç serpmek.
12. Ince uçlu forseps ve küçük yaylı makas kullanılarak, karotis çevresindeki peri-adventisyal dokular dikkatle çıkarın. Bu temizleme adımı sırasında karotis sıkmak veya germek için dikkatli olun.
13. Kes, arkus aorta ve karotis bifurkasyon üzerinde ligasyonu noktaları arasındaki sol karotis arter.
14. Sağ karotis arter, sağ subklavian arter dallanma noktası ve karotid bifurkasyon arasında kesin.
15. Buz HBSS içeren, 35 mm kültür çanak karotis aktarın. Gerekirse, kalan peri-adventisyal doku dikkatlice çıkarın.
16. Her karotis başına 150 ul QIAsol lizis tamponu (Qiagen) ile doldurarak 29g bir iğne ile insülin şırınga (3 / 10 ml şırınga) hazırlayın.
17. Karotis bir ucunda iğne ucu dikkatlice yerleştirin.
18. Karotis ve iğne ucu bir forseps ile tutarken, hızlı (~ 1 sn) (intima eluat) 1.5ml bir tüpe QIAsol lizis tamponu (150 ul) temizler.
19. Karotis artık (medya + adventisya) bir kez HBSS, 1.5 ml tüp koymak ve sıvı nitrojen içinde ek-freeze durulayın.
20. İntima eluat ve donmuş artık üreticinin talimatlarına göre miRNeasy mini kiti (QIAGEN) intimal kullanarak ya da medya + adventisya RNA izolasyonu için kullanılır.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Biz kısmen fare karotid arterler ve ultrason muayenesi prosedürü izleyerek bir gün gerçekleştirildi sol bağlandı. Şekil 1'de gösterildiği gibi, başarılı kısmi ligasyonu kan akım hızını azaltır ve sol karotis arter diyastol sırasında akış (akış rahatsız) tersine çevirir. Yüksek yağlı diyet ile birlikte ApoE nakavt (KO) farelerde Kısmi ligasyonu, sol karotis arter (LCA) sağlam ateroskleroz neden olur, ancak sağ kontralateral karotis, iki hafta (Şekil 2). Karotis intima toplanan RNA gibi PECAM-1 gibi endotel işaretleyici genleri içeren bir-SMA (Şekil 3) medial düz kas hücre işaretleyici genlerin.

Şekil 1: Şematik, karotis anatomisi ve ligasyonu : Üç şube sol karotis arter (LCA) [eksternal karotid arter (ECA), internal karotis arter (ICA) ve oksipital arter (OA)] üstün tiroid arter (STA) açık bırakarak, bağlandı.

Şekil 2: ultrason görüntüleri akış hızı profilleri ve kısmi ligasyonu diyastolde LCA akış tersine (oklarla gösterilen) uyardığı ortaya. RCA Akış bağlanmasından sonra değişmeden kalır.

Şekil 3: Kısmi ligasyonu ve yüksek yağlı diyet hızla LCA ApoE KO farelerde ateroskleroz neden olur ApoE KO farelerin kısmen bağlandı ve 1 ila 3 hafta boyunca yüksek yağlı diyetle beslendi. LCA dondurulmuş bölümleri Petrol-Kırmızı-O ile boyandı.

Şekil 4 intimal RNA hazırlama yöntemi. Intimal RNA ve medial + adventisyal (m +) RNA sahte çalışan RCA ve LCA C57BL / 6 fareler elde edildi. RNA'lar PECAM-1 ve α-SMA 18s kullanarak bir iç kontrol sistemi olarak yarı-kantitatif RT-PCR (A) ve qPCR (B, C) ​​ile analiz edildi. Çubuk grafikler, ortalama ± SEM, n = 3.

Discussion

Bu yöntemde, eksternal karotid, internal karotid, oksipital arter ve üstün tiroid arter da dahil olmak üzere karotis tüm şube uygun bir şekilde tanımlanması çok önemlidir. Gösterildiği gibi ultrason kullanarak akış modeli doğrulamak için de önemlidir. Deneyimli ellerde, 500'den fazla farelerin ultrason çalışmaları dayalı kısmi ligasyonu ameliyatlarında başarı oranı% 90 daha iyidir. Karotis intimal RNA hazırlıkları için, ilk perfüzyon adımdan sonra, karotis görünümünü dikkat etmek önemlidir. Bu noktada sol karotis akışının tıkanması kanıt varsa, biz daha fazla analiz için bu örnekler kullanılarak tavsiye etmiyoruz.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Normal Saline (0.9% sodium chloride)	Baxter Internationl Inc.	2B1323
Insulin syringe (3/10 ml 29g syringe)	Tyco Healthcare, Covidien	8881600145
HBSS	Cellgro	21-023
miRNeasy mini kit (including, QIAzol)	Qiagen	217004
Vevo 770 High-Resolution Micro-Imaging System	VisualSonics, inc.	a.Visualsonics 770 system b.Imaging stage c.Vevo integrated rail system d.RMV scan head for mice	or similar system
6-0 Silk Suture, sterile	Covidien	s-1172 c2
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5675	or similar
Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5005	or similar
Tissue Mend II	Webster Veterinary	07-856-7946