Summary
阿尔茨海默氏病的一个特点是海拔的Aβ
Abstract
突触连接的减值可能健忘症在阿尔茨海默病（AD）的早期阶段发生的微妙变化的基础。被称为β-淀粉样蛋白（Aβ），在AD中高量生产的一种肽，以减少长时程增强（LTP），蜂窝的学习和记忆相关的。事实上，由Aβ引起的LTP的减值是一个有用的实验范式，研究AD模型和筛选药物能够减轻或恢复这种突触损伤的突触功能障碍。有研究表明，Aβ的产生通过其低聚体形式的LTP中断优先。在这里，我们提供oligomerized合成灌注损害LTP的一个详细的协议到急性海马Aβ1- 42肽。在这段视频中，我们概括为低聚Aβ的准备一步一步程序
Protocol
Resuspendingβ-淀粉样肽
在开始之前已经做好准备：
- Aβ1- 42（冻干粉）
- 1,1,1,3,3,3 - 六氟-2 - 丙醇（异丙醇）
- 低结合的聚丙烯离心管（1.5毫升）
- 气密汉密尔顿注射器聚四氟乙烯暴跌停止（250μL）
- 二甲基亚砜（DMSO）
- 允许冻干Aβ1- 42平衡30分钟，在室温下，以避免开放肽小瓶后的凝结。
- 通风柜下，重新暂停在冰冷的异丙醇Aβ1- 42肽获得1毫米的解决方案和涡几秒钟的解决方案。
- 使用聚四氟乙烯插件的玻璃气密汉密尔顿注射器，快速分裂的Aβ1-42 /异丙醇溶液，同样分为三个聚丙烯瓶和密封的小瓶。
- 小瓶，然后培养2小时，以便Aβ的monomerization。接下来，打开小瓶和集中Aβ1- 42 /异丙醇溶液，在真空条件下使用，直到一个明确的肽膜是在瓶底部观察一个SpeedVac离心（800克，室温）。仔细检查SpeedVac离心机内的温度，以避免肽降解（最大25 ° C）。
- 密封样品瓶和储存的分装，于-80 ° C。 Aβ的电影，可存放6个月。
- 重悬，加入DMSO获得浓度可达5毫米的Aβ1-42一部电影。超声在10分钟的水浴，以确保完整的再悬浮。
- 分装这个5MM的Aβ1-42解决方案，到聚丙烯瓶。密封所有的样品瓶和储存在-20 ° C等分应解冻一次。提防内冷冻凝结水。溶液中的肽很容易降解。
齐聚
在开始之前已经做好准备：
- Aβ1- 42 / DMSO（5MM）
- 无菌磷酸盐缓冲液
- 低结合的聚丙烯离心管（1.5毫升）
- 低结合的聚丙烯离心管（50毫升）
- 稀释获得5MMAβ1- 42 / DMSO用无菌磷酸盐缓冲液（高达100μL）等分。
- 涡30秒，然后孵育12小时，在4 ° C
海马脑片治疗
当治疗海马，重要的是，以避免非特异性肽粘附到烧杯中，灌注管表面，和录音室。优先使用低结合的聚丙烯管道和容器。避免使用玻璃器皿或通用塑料制品。灌注媒体应血清白蛋白。
Aβ的灌注
在开始之前已经做好准备：
- OligomerizedAβ1- 42
- 记录缓冲区（单位：mm：124氯化钠，4.4氯化钾，碳酸氢钠3，2 1 NA 2 HPO 4，25 2 氯化钙 ，氯化镁2，和10葡萄糖）
- 电生理记录的设置与接口室
- 含氧解剖后孵育至少90分钟的录音缓存横向海马（T = 29℃;不断灌注率= 2毫升/分钟）
- 紧接实验之前，淡化oligomerized的Aβ1-42等分合适的工作浓度（200纳米或更高），聚丙烯管与预氧化录音缓冲区。
- 灌注20分钟前诱导突触可塑性的切片Aβ1- 42解决方案。
诱导的可塑性和后续
- 通常情况下，最广泛使用的模型突触可塑性的LTP。它可以通过一个在海马突触强直刺激引起的。我们之间的谢弗抵押品的预测和阶层radiatum CA1区锥体神经元突触记录现场的反应。我们的强直刺激由一个THETA突发刺激，其中包括3列车以15秒间隔隔开。每列列车由10连发在5 Hz，在每一个突发需要在100赫兹的5个脉冲。应用强直刺激后立即oligomerized的Aβ灌注已经完成。
- 强直刺激后立即切换回正常录制缓冲液灌注。保持恒定的灌注率，录音室的温度，在整个实验的持续时间和适当的充氧。
代表性的成果和可能出现的问题
oligomerized根据Stine等中学古典协议1，Aβ的生成Aβ的单体及各种大小不同的低聚物S（二聚体，三聚体，等）oligomerized灌注Aβ1- 42导致减少Aβ处理的切片相比，控制片的LTP的。在我们的实验条件下，在3-5月龄只C57BL/6J雄性小鼠用于，在200 nm的LTP的Aβ处理的切片平均强直刺激后在两个小时的基准值的150％，而在控制片LTP的价值观平均200-250 baseline2％。在某些情况下，与Aβ的治疗，可能会失败，以减少海马LTP。几个关键可能发生的错误，包括过度膜干燥过程中Aβ的浓度和不完整齐聚的。在海马的Aβ灌注可能是另一个值得关注的，因为溶液中的Aβ肽，这是容易出现非特异性粘附于塑料的物理化学性质的源。疑难排解这些问题将在下面讨论。
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Discussion
如上所述，在编制低聚Aβ的几个问题可能会导致在受到损害LTP的。评估是否可能发生Aβ的降解或缺乏对Aβ齐聚的方法之一是评估使用的Tris -甘氨酸页/免疫印迹分析和分析超速离心（未在本协议中所述）Aβ的准备。当免疫印迹样品准备non-denaturing/non-reducing条件下，一个成功的准备工作应产生免疫印迹签名具有对应单体及不同的低聚物3的乐队。一个经常发生的问题是在SpeedVac浓缩干燥步骤肽不稳定。事实上，高温干燥，导致蛋白质的降解，明显标记肽色至褐色。的异丙醇溶液的浓度在室温下进行仔细监测。鉴于发生在该协议的程序的几个步骤，在稀释的错误可能会意外地导致贫困齐聚或具误导性的Aβ浓度。有趣的是，与Aβ的浓度低于建议灌注会导致LTP的值增加3。再次，灌注影响的片Aβ的治疗可能的结果。事实上，在我们的电生理实验液维持恒温，是至关重要的，因为温度影响Aβ的构象，在磷酸盐缓冲液解决时。另一个令人关切的是低聚Aβ的非特异性坚持作准备，从而降低了有效浓度暴露海马灌注的容器和管材的塑料表面。因此，关键是使用低蛋白结合的塑料制品，以确保可靠的筹备工作和整个不同的实验灌注。在这个问题上，我们建议聚丙烯塑料制品，这已被证明不影响种不同的Aβ4的比例。大量文献表明，阿尔茨海默氏病起源作为突触障碍5。最早的失忆症状的精妙之处和可变性，在任何其他脑损伤的临床体征情况下发生的，很可能是离散变化，在一个单一的突触的功能，至少部分由Aβ的物种产生，是由于（例如，Aβ42和Aβ40）2,6,7,8。这一发现一制剂含有oligomerized合成的Aβ1-42损害9 LTP的体外诱导的Aβ在大脑海拔突触功能障碍的机制，导致大量调查。使用此协议，我们描述了一个过程，成功地损害谢弗抵押品阶层radiatum连接海马LTP的低聚Aβ的准备。这个实验范式，具有巨大价值的研究Aβ介导的的发病机制以及潜在的药物测试，这可能减轻突触功能障碍 2,10,11 。
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Disclosures
动物实验是由哥伦比亚大学IACUC规定的准则和法规的规定执行。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院国家神经疾病与中风研究所（NINDS）（NS049442）的支持。>
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aβ 1-42 (lyophilized) | American Peptide | 62-0-80 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) | Fluka | 52517 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Biotium, Inc. | 90082 | |
| 50mL Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 05-538-67 | |
| 1.5ml MaxyClear microtubes Maximum recovery | Axygen Scientific | MCT-150-L-C | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| GASTIGHT Syringes 250 μL | Hamilton Co | 1725 | |
| Bath sonicator | Branson | 3510 | |
| Savant SpeedVac Concentrator System | Various | SC 110A |
References
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