Summary
Ein Merkmal der Alzheimer-Krankheit ist die Erhöhung der Aß
Abstract
Wertminderung von synaptischen Verbindungen geeignet ist, die subtilen amnesic Veränderungen in den frühen Stadien der Alzheimer-Krankheit (AD) zugrunde liegen. β-Amyloid (Aß), ein Peptid, in hohen Mengen in AD produziert, ist bekannt, dass Langzeit-Potenzierung (LTP), ein zelluläres Korrelat von Lernen und Gedächtnis zu reduzieren. In der Tat ist LTP Beeinträchtigung durch Aß verursacht eine nützliche experimentelle Paradigma zur Untersuchung synaptischer Funktionsstörungen in AD-Modellen und zum Screening von Drogen in der Lage zu mildern oder Zurücksetzen wie synaptic Beeinträchtigungen. Studien haben gezeigt, dass Aß die LTP Unterbrechung produziert bevorzugt über ihr oligomerer Form. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für beeinträchtigen LTP durch Perfusion von oligomerisierten synthetischen Aβ1-42-Peptid auf akuten Schnitten des Hippocampus. In diesem Video, skizzieren wir eine Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Herstellung von oligomeren Aß
Protocol
Resuspendieren β-Amyloid-Peptid
Bevor Sie beginnen müssen bereit:
- Aß 1-42 (gefriergetrocknetes Pulver)
- 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol (HFIP)
- Low-Bindung Polypropylen Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml)
- Gasdichte Hamilton-Spritze mit Teflon stürzen zu stoppen (250 ul)
- Dimethylsulfoxid (DMSO)
- Lassen lyophilisiert Aß 1-42 bei Raumtemperatur für 30 Minuten ins Gleichgewicht zu Kondensation beim Öffnen der Peptid-Fläschchen zu vermeiden.
- Unter der Abzugshaube, resuspendieren Aß-Peptid 1-42 in eiskaltem HFIP zu einer 1 mM Lösung und Vortex die Lösung für ein paar Sekunden zu erhalten.
- Mit einem Glas Gasdichte Hamilton-Spritze mit Teflon-Stecker, schnell teilen die Aß 1-42 / HFIP-Lösung in drei gleich große Polypropylen Ampullen und dichten die Gefäße.
- Die Fläschchen werden dann für 2 Stunden inkubiert, um für Aß Monomerisierung ermöglichen. Dann öffnen Sie die Fläschchen und konzentrieren die Aß 1-42 / HFIP Lösung unter Vakuum mit Hilfe eines SpeedVac Zentrifuge (800 g, Raumtemperatur), bis eine klare Peptid-Film ist an der Unterseite der Fläschchen beobachtet. Prüfen Sie sorgfältig die Temperatur im Inneren des SpeedVac Zentrifuge Peptidabbau vermeiden (max 25 ° C).
- Verschließen Sie die Fläschchen und speichern Sie die Aliquots bei -80 ° C. Aß Film kann für 6 Monate gespeichert werden.
- Re-suspend ein Film, indem DMSO zu einer Konzentration von bis zu erhalten, um 5 mM Aß 1-42. Mit Ultraschall im Wasserbad für 10 Minuten, um sicherzustellen, komplette Resuspension.
- Aliquot dieser 5mM Aß 1-42 Lösung in Polypropylen Ampullen. Seal alle Fläschchen und lagern Sie sie bei -20 ° C. Aliquots sollten nur einmal aufgetaut werden. Hüten Sie sich Kondenswasser im Inneren der Tiefkühltruhe. Peptide in Lösung zersetzen sich sehr leicht.
Oligomerisierung
Bevor Sie beginnen müssen bereit:
- Aß 1-42 / DMSO (5mm)
- Sterile Phosphat-Puffer
- Low-Bindung Polypropylen Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml)
- Low-Bindung Polypropylenzentrifugenröhrchen (50 ml)
- Verdünnen Sie die erhaltenen 5mM Aß 1-42 / DMSO Aliquot mit sterilem Phosphatpuffer (bis zu 100 ul).
- Vortex für 30 Sekunden und anschließend 12 Stunden lang bei 4 ° C
Hippokampalen Slice Behandlung
Bei der Behandlung von Schnitten des Hippocampus, ist es wichtig, nicht-spezifische Peptid Haftung auf Bechern, Infusionsschlauch Flächen und die Aufnahme Kammer zu vermeiden. Verwenden Sie bevorzugt low-Bindung Polypropylen Rohre und Behälter. Vermeiden Sie die Verwendung von Glas-oder Kunststoff-generic-ware. Perfusion Medien sollten Serum-oder Albumin-frei.
Aß Perfusion
Bevor Sie beginnen müssen bereit:
- Oligomerisiert Aß 1-42
- Recording-Puffer (in mM: 124 NaCl, 4,4 KCl, 1 Na 2 HPO 4, 25 NaHCO 3, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2 und 10 Glukose)
- Elektrophysiologische Aufzeichnung Set-up mit Schnittstelle Kammer
- Quer Schnitten des Hippocampus in Sauerstoff Aufzeichnungspuffer für mindestens 90 Minuten nach der Präparation inkubiert (T = 29 ° C; konstant Perfusionsrate = 2 ml / Minute)
- Unmittelbar vor dem Experiment, verdünnen oligomerisiert Aß 1-42 Aliquot auf den entsprechenden Arbeitsgruppen Konzentration (200 nM oder höher) in einem Polypropylen-Rohr mit pre-Sauerstoff Aufzeichnungspuffer.
- Versorgen die Aß 1-42 Lösung für 20 Minuten, um die Scheiben vor der Induktion der synaptischen Plastizität.
Induktion von Plastizität und Follow-up
- Typischerweise ist der am weitesten verbreitete Modell der synaptischen Plastizität der LTP. Es kann durch tetanische Stimulation eines bestimmten Synapsen im Hippocampus induziert werden. Wir Datensatzfeld Antworten von Synapsen zwischen den Shaffers Sicherheiten Projektionen und CA1 pyramidalen Neuronen in der Schicht radiatum. Unsere tetanische Stimulation besteht aus einem Theta-Burst Stimulation, die 3-Züge um 15 Sekunden getrennt sind. Jeder Zug besteht aus 10 Ausbrüche bei 5 Hz, wo jeder Burst bringt 5 Impulse bei 100 Hz. Übernehmen Sie die tetanische Stimulation unmittelbar nach der Perfusion der oligomerisiert Aß abgeschlossen ist.
- Unmittelbar nach der tetanischen Stimulation wieder auf Perfusion mit normaler Aufnahme-Puffer. Aufrechterhaltung einer konstanten Perfusionsrate, Aufnahme Kammertemperatur und ordnungsgemäße Sauerstoffversorgung während der gesamten Dauer des Experiments.
Repräsentative Ergebnisse und mögliche Probleme
Die Aß oligomerisiert nach dem klassischen Protokoll Stine et coll. 1 erzeugt Aß Monomeren und eine Vielzahl von Oligomeren unterschiedlicher Größes (Dimer, Trimer, etc.) Die Perfusion des oligomerisiert Aß 1-42 führt zu einer verminderten LTP in Aß-behandelten Scheiben im Vergleich zur Kontrollgruppe Scheiben schneiden. Unter unseren experimentellen Bedingungen, wo 3-5 Monate alten C57BL/6J männlichen Mäusen verwendet werden, LTP in 200 nM Aß-behandelten Scheiben auf durchschnittlich 150% der Ausgangswerte in zwei Stunden nach dem tetanischen Stimulation, während die Kontrolle Scheiben LTP-Werte im Durchschnitt 200-250% der baseline2. In einigen Fällen kann die Behandlung mit Aß nicht zu hippocampalen LTP zu reduzieren. Mehrere kritische Fehler, die auftreten könnten, umfassen ein extremes Filmtrocknung während Aß-Konzentration und unvollständiger Oligomerisierung. Aß Perfusion in Schnitten des Hippocampus könnte ein weiterer Anlass zur Sorge wegen der physikalisch-chemischen Eigenschaften des Aß-Peptid in Lösung, die anfällig für unspezifische Haftung auf Kunststoffen ist. Troubleshooting von diesen Fragen wird im Folgenden erörtert.
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Discussion
Wie oben beschrieben, können verschiedene Probleme in der Herstellung von oligomeren Aß in unbeeinträchtigt LTP führen. Eine Möglichkeit zu prüfen, ob Aß Abbau oder der Mangel an Aß Oligomerisierung stattgefunden haben könnte ist, die Aß Vorbereitung mit Tris-Tricin PAGE / Western Blot-Analyse und analytische Ultrazentrifugation (noch nicht in diesem Protokoll beschrieben) zu bewerten. Als Western Blot Proben unter non-denaturing/non-reducing Bedingungen vorbereitet sind, sollte eine erfolgreiche Vorbereitung erzeugen eine Western Blot Unterschrift mit Banden, die Monomere und Oligomere verschiedene 3. Eine oft auftretende Problem ist das Peptid Instabilität während der Trocknung in der SpeedVac Konzentrator. In der Tat führt Hochtemperatur-Trocknung auf Proteinabbau, erkennbar an markierten Peptid Färbung braun. Die Konzentration der HFIP-Lösung muss bei Raumtemperatur durchgeführt werden und sorgfältig zu überwachen. Angesichts der verschiedenen Verfahrensschritte vorkommende in das Protokoll, können Fehler in Verdünnung versehentlich den armen Oligomerisierung oder irreführende Aß-Konzentration führen. Interessanterweise würden die Perfusion mit Aß-Konzentrationen niedriger als empfohlen in erhöhte LTP-Werte Suchergebnis 3. Auch hier wirkt sich Perfusion das mögliche Ergebnis des Aß-Behandlung auf Scheiben schneiden. In der Tat, die Aufrechterhaltung einer konstanten Temperatur des Bades in unseren elektrophysiologischen Experimenten ist kritisch, da Temperatur bekannt ist, dass Aß Konformationen beeinflussen, wenn in Phosphatpuffer gelöst. Ein weiterer Anlass zur Sorge ist, dass oligomere Aß kann unspezifisch an Kunststoffoberflächen von Behältern und Rohrleitungen für die Vorbereitung und die Durchblutung wodurch die effektive Konzentration ausgesetzt Schnitten des Hippocampus verwendet Stick. Daher ist es wichtig, Low-Protein-Bindung Kunststoff-ware nutzen, um zuverlässige Präparate und Infusionen in verschiedenen Experimenten zu gewährleisten. In dieser Ausgabe, schlagen wir Polypropylen-Kunststoff-ware, die gezeigt worden ist, nicht auf das Verhältnis der verschiedenen Aß Spezies 4 beeinflussen. Umfangreiche Literatur legt nahe, dass die Alzheimer-Krankheit als eine synaptische Störung 5 stammt. Es ist wahrscheinlich, dass die Subtilität und Variabilität der frühesten amnestischen Symptome, welche in der Abwesenheit aller anderen klinischen Anzeichen von Hirn-Trauma, durch diskrete Veränderungen in der Funktion eines einzelnen Synapse, zumindest teilweise hergestellt, indem man Aß Arten sind ( zB Aß 42 und Aß 40) 2,6,7,8. Die Entdeckung, dass eine Zubereitung, die oligomerisiert synthetischen Aß 1-42 kann LTP 9 in vitro beeinträchtigt hat zu zahlreichen Untersuchungen zu Mechanismen der synaptischen Dysfunktion durch Aß Erhebung im Gehirn induziert geführt. Mit diesem Protokoll, beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von oligomeren Aß, die erfolgreich beeinträchtigt LTP im Shaffer Sicherheiten-Stratum radiatum Verbindung in Schnitten des Hippocampus. Dieses experimentelle Paradigma hat einen enormen Wert für die Untersuchung von Mechanismen der Aß-vermittelte Pathogenese sowie das Testen potenzieller Medikamente, die zu mildern synaptische Dysfunktion kann 2,10,11.
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Disclosures
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der Columbia University IACUC gesetzt durchgeführt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS049442) unterstützt.>
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aβ 1-42 (lyophilized) | American Peptide | 62-0-80 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) | Fluka | 52517 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Biotium, Inc. | 90082 | |
| 50mL Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 05-538-67 | |
| 1.5ml MaxyClear microtubes Maximum recovery | Axygen Scientific | MCT-150-L-C | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| GASTIGHT Syringes 250 μL | Hamilton Co | 1725 | |
| Bath sonicator | Branson | 3510 | |
| Savant SpeedVac Concentrator System | Various | SC 110A |
References
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