Summary
アルツハイマー病の特徴のひとつは、Aβの上昇です。
Abstract
シナプス結合の減損は、アルツハイマー病（AD）の初期段階で発生する微妙な健忘の変化の根底にある可能性があります。 β-アミロイド（Aβ）、ADで多量に生産さペプチドは、細胞が学習と記憶の相関長期増強（LTP）を、減少させることが知られている。確かに、Aβに起因するLTPの障害は、ADのモデルで、そのようなシナプス障害を軽減または復帰が可能なスクリーニング薬のシナプス機能障害を研究するための有用な実験パラダイムである。研究は、Aβがそのオリゴマーフォームを経由して優先的にLTP混乱をもたらすことが示されている。ここでは、オリゴマー合成の灌流による急性海馬スライスにAβ1- 42ペプチドを損なうLTPの詳細なプロトコルを提供しています。このビデオでは、我々はオリゴマーAβの調製のためのステップバイステップの手順を概説
Protocol
再懸濁β-アミロイドペプチド
始める前には用意しておいてください。
- Aβ1-42（凍結乾燥粉末）
- 1,1,1,3,3,3 - ヘキサフルオロ-2 - プロパノール（HFIP）
- 低結合ポリプロピレン製微量遠心チューブ（1.5 ml）を
- テフロンのプランジストップ付気密ハミルトンシリンジ（250μl）を
- ジメチルスルホキシド（DMSO）
- 凍結乾燥Aβ1-42は、ペプチドバイアルを開くときに結露を避けるために、30分間室温で平衡させる。
- ヒュームフードの下で、1 mM溶液と数秒間ボルテックス解を得るために、氷冷HFIPにAβ1-42ペプチドを再サスペンド。
- テフロンプラグ付ガラス気密ハミルトンシリンジを使用して、迅速に等しくthreeポリプロピレンバイアルにAβ1-42 / HFIPソリューションを分割し、バイアルを密封する。
- バイアルは、Aβmonomerizationを可能にするために2時間インキュベートする。次に、バイアルを開いて、明確なペプチド膜がバイアルの底部に観察されるまでSpeedVac遠心分離機（800グラム、室温）を用いて真空下でAβ1-42 / HFIPのソリューションを集中する。 （最大25 ° C）ペプチド分解を避けるために、SpeedVac遠心分離機内部に慎重に温度を確認してください。
- バイアルを密封し、-80アリコート℃にて保存してください。 Aβフィルムは、6ヶ月間保存することができます。
- 5mMのAβ1-42までの濃度を得るためにDMSOを添加して1フィルムを再懸濁する。再懸濁を完全に保証するために10分間水浴中に超音波処理。
- ポリプロピレン製バイアルに分注しこの5mMのAβ1-42のソリューション。すべてのバイアルを密封し、-20℃で保管しますアリコートを解凍は1回限りです。冷凍庫内の水の結露について。溶液中のペプチドは、非常に容易に低下する。
オリゴマー化
始める前には用意しておいてください。
- Aβ1-42 / DMSO（5mm）で
- 滅菌リン酸緩衝液
- 低結合ポリプロピレン製微量遠心チューブ（1.5 ml）を
- 低結合ポリプロピレン遠心チューブ（50ml）を
- 滅菌リン酸緩衝液（最大100μl）を、得られた5mMのAβ1-42 / DMSOのアリコートを希釈する。
- その後30秒間ボルテックスし、4℃で12時間インキュベート° C
海馬スライスの治療
海馬スライスを治療する際に、それはビーカー、灌流チューブの表面、および記録室への非特異的ペプチドの付着を回避することが重要です。優先的に低結合ポリプロピレンチューブと容器を使用してください。ガラスまたはプラスチック製のウェアのジェネリックの使用は避けてください。潅流媒体は、血清またはアルブミンフリーでなければなりません。
Aβ灌流
始める前には用意しておいてください。
- オリゴマーAβ1-42
- 録音バッファ（mMで：124のNaCl、4.4 KClを、1のNa 2 HPO 4、25のNaHCO 3、2のCaCl 2、2のMgCl 2、および10グルコース）
- インタフェースのチャンバーとセットアップ電気生理学的記録
- 少なくとも90分後の解剖のために酸素を記録バッファー中でインキュベート横海馬スライス（T = 29℃、一定の血流速度は= 2ml /分）
- 実験の直前に、事前に酸素記録バッファとポリプロピレンチューブに適切な作業の濃度（200nMのまたはそれ以上）にオリゴマーAβ1-42アリコートを希釈する。
- シナプス可塑性の誘導の前にスライス〜20分間、Aβ1-42のソリューションを灌流。
可塑性の誘導とフォローアップ
- 通常は、シナプス可塑性の最も広く使用されているモデルはLTPです。それは、海馬内の特定のシナプスのテタヌス刺激によって誘導することができる。我々は、シェイファーの担保の予測と地層のradiatumのCA1錐体ニューロン間のシナプスからフィールドの応答を記録。私たちのテタヌス刺激は15秒間隔で区切られた3列車を含むシータバースト刺激で構成されています。各列車は、各バーストは、100Hzで5パルスを伴う5Hzで10バーストで構成されています。オリゴマーAβの血流が完了した直後にテタヌス刺激を適用します。
- すぐにテタヌス刺激後に通常の録画用緩衝液で灌流に戻ります。実験期間を通じて一定の灌流速度、記録室の温度と適切な酸素化を維持する。
代表的な成果と可能性のある問題
スタインらcollの古典的なプロトコル。1に記載のオリゴマーAβは、Aβモノマーとの様々な異なるサイズのオリゴマーを生成するS（二量体、三量体、など）オリゴマーの血流制御のスライスと比較してAβ処理のスライスに減少LTPにAβ1-42リード。コントロールのスライスでLTPの値が存在するあいだは3〜5ヶ月のC57BL/6J雄性マウスを使用している我々の実験条件の下で、LTPは200 nMでAβ処理のスライスは、テタヌス刺激後2時間におけるベースライン値の平均150パーセントになりますbaseline2の平均200から250パーセントで。いくつかのケースでは、Aβによる治療は、海馬LTPを減らすために失敗することがあります。発生する可能性のあるいくつかの重大なエラーは、Aβ濃度と不完全なオリゴマー化の間に乾燥過度のフィルムが含まれています。海馬切片におけるAβ灌流は、懸念のためにプラスチックに非特異的な接着が起こりやすいソリューションのAβペプチドの物理化学的性質の別のソースかもしれません。これらの問題のトラブルシューティングについては後述する。
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Discussion
上述したように、オリゴマーAβの準備にはいくつかの問題が健常LTPになることがあります。 Aβ分解またはAβオリゴマー化の欠如が発生した可能性がありますかどうかを評価する一つの方法は、トリス - トリシンPAGE /ウエスタンブロット分析および分析超遠心を（このプロトコールに記載されていません）を使用してAβの準備を評価することです。ウェスタンブロッティングのサンプルがnon-denaturing/non-reducing条件下で調製されている場合、成功する準備はモノマーと異なるオリゴマー3に対応するバンドをフィーチャーしたウェスタンブロッティング署名を生成する必要があります。頻繁に発生する問題は、SpeedVacコンセントレータの乾燥工程中のペプチド不安定です。実際には、高温乾燥は、茶色に顕著なペプチドの着色によって顕著な、蛋白質の劣化につながります。 HFIP溶液の濃度は、室温で実施し、注意深く監視する必要があります。プロトコルで発生するいくつかの操作手順を与え、希釈のエラーが誤って悪いオリゴマーまたは誤解を招くようなAβ濃度につながる可能性があります。興味深いことに、提案されたよりも低いAβ濃度と血流が増加したLTPの値は3に結果になる。再び、血流は、スライス上のAβ治療の可能性のある結果に影響を与えます。確かに、私たちの電気生理学実験における浴溶液の温度を一定に維持する温度がリン酸緩衝液中で解決するときにAβコンフォメーションに影響を与えることが知られているように重要です。懸念のもう一つの源はオリゴマーAβが非特異的にそれによって海馬スライスにさらさ有効濃度を減少させる準備と灌流のために使用される容器と配管のプラスチック表面に付着可能性があるということです。従って、それは別の実験を通して信頼性の高い調剤とperfusionsを確保するため、低タンパク質結合プラスチックウェアを使用することが重要です。この号では、我々は、異なるAβの種4の比率に影響を与えないように示されているポリプロピレンプラスチックウェアを提案する。広範な文献は、アルツハイマー病は、シナプスの障害5として発信されたことを示唆している。それは、脳損傷の他の臨床徴候がない場合に発生する初期の健忘の症状の繊細さと可変性が、、Aβ種によって少なくとも部分的に生成された単一シナプスの機能に離散的変化、、（によるものであると考えられるたとえばAβ42およびAβ40）2,6,7,8。オリゴマー合成Aβ1-42を含有する製剤は、in vitroで LTP 9を損なうことができるという発見は、脳内のAβ上昇によって誘発されるシナプス機能障害のメカニズムの数々の調査につながっている。このプロトコルを使用して、我々は成功した海馬スライスにおけるシェイファー担保地層radiatum接続でLTPを損なうオリゴマーAβを調製するための手順を説明します。この実験的なパラダイムは、Aβを介した病原性のメカニズムを調べるだけでなく、シナプス機能障害2,10,11を緩和する可能性のある薬物を、テストするための非常に大きな価値を持っています。
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Disclosures
動物実験は、コロンビア大学IACUCによって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。
Acknowledgments
この作業は、神経疾患や脳卒中のNIH国立研究所（NINDS）（NS049442）によってサポートされていました。>
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aβ 1-42 (lyophilized) | American Peptide | 62-0-80 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) | Fluka | 52517 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Biotium, Inc. | 90082 | |
| 50mL Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 05-538-67 | |
| 1.5ml MaxyClear microtubes Maximum recovery | Axygen Scientific | MCT-150-L-C | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| GASTIGHT Syringes 250 μL | Hamilton Co | 1725 | |
| Bath sonicator | Branson | 3510 | |
| Savant SpeedVac Concentrator System | Various | SC 110A |
References
- Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278, 11612-11622 (2003).
- Vitolo, O. V. Amyloid beta -peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 13217-13221 (2002).
- Puzzo, D. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. J Neurosci. 28, 14537-14545 (2008).
- Lewczuk, P. Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides. Clin Chem. 52, 332-334 (2006).
- Masliah, E. Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Histol Histopathol. 10, 509-519 (1995).
- Cullen, W. K., Suh, Y. H., Anwyl, R., Rowan, M. J. Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments. Neuroreport. 8, 3213-3217 (1997).
- Itoh, A. Impairments of long-term potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats. Eur J Pharmacol. 382, 167-175 (1999).
- Walsh, D. M. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature. 416, 535-539 (2002).
- Lambert, M. P. nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6448-6453 (1998).
- Gong, B. Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory. Cell. 126, 775-788 (2006).
- Trinchese, F. Inhibition of calpains improves memory and synaptic transmission in a mouse model of Alzheimer disease. J Clin Invest. 118, 2796-2807 (2008).
