Summary
ميزة واحدة لمرض الزهايمر هو ارتفاع Aβ
Abstract
ضعف الاتصالات متشابك من المحتمل أن تكمن وراء التغييرات الطفيفة التي تحدث في نساوي المراحل المبكرة من مرض الزهايمر ق (AD). ومن المعروف β اميلويد (Aβ) ، الببتيد التي تنتج في كميات عالية في ميلادي ، للحد بعيدة المدى (الكمونية) ، وهي الخلوية ربط التعلم والذاكرة. في الواقع ، بسبب ضعف LTP Aβ هو نموذج تجريبي لدراسة مفيدة متشابك اختلالات في النماذج ميلادي والفرز على المخدرات قادرة على التخفيف من العاهات أو العودة متشابك من هذا القبيل. وقد أظهرت الدراسات التي تنتج Aβ تعطل LTP تفضيلي عبر شكله oligomeric. هنا نقدم بروتوكول مفصلة للعرقلة من قبل LTP نضح الاصطناعية oligomerized Aβ1 - 42 على شرائح الببتيد الحصين الحادة. في هذا الفيديو ، ونحن المخطط إجراء خطوة بخطوة لإعداد Aβ oligomeric
Protocol
إعادة التعليق β اميلويد ببتيد
لقد بدأت قبل الحصول على استعداد :
- Aβ 1-42 (مسحوق مجفف بالتجميد)
- 1،1،1،3،3،3 - Hexafluoro - 2 - بروبانول (HFIP)
- منخفضة ملزم أنابيب البولي بروبلين microcentrifuge (1.5 مل)
- GasTight هاميلتون المحاقن مع وقف الهبوط تفلون (250 ميكرولتر)
- Dimethylsulfoxide (DMSO)
- تسمح Aβ مجفد 1-42 لكي تتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لتجنب التكثيف عند فتح القارورة الببتيد.
- تحت غطاء الدخان ، وإعادة تعليق Aβ 1-42 الببتيد في HFIP الجليد الباردة للحصول على حل من 1 ملم ودوامة الحل لبضع ثوان.
- باستخدام محقنة زجاجية هاميلتون GasTight مع المكونات تفلون ، تقسيم بسرعة Aβ 1-42 / HFIP حل بالتساوي في قوارير البولي بروبلين الثلاث وختم القوارير.
- ثم يتم تحضين قارورة لمدة 2 ساعة للسماح للmonomerization Aβ. المقبل ، فتح قنينة والتركيز على حل Aβ 1-42 / HFIP ظل فراغ باستخدام جهاز للطرد المركزي SpeedVac (800 غرام ، درجة حرارة الغرفة) وحتى لوحظ الفيلم الببتيد واضحة في الجزء السفلي من قنينة. الاختيار بعناية درجة الحرارة داخل أجهزة الطرد المركزي لتجنب تدهور SpeedVac الببتيد (حد أقصى 25 درجة مئوية).
- ختم القنينات وتخزين aliquots في -80 درجة مئوية. ويمكن تخزين فيلم Aβ لمدة 6 أشهر.
- اعادة تعليق فيلم واحد عن طريق إضافة DMSO للحصول على تركيز تصل إلى 5 ملي Aβ 1-42. يصوتن في حمام مائي لمدة 10 دقيقة كاملة لضمان اعادة التعليق.
- قسامة هذا Aβ 5mM 1-42 حل في قوارير البولي بروبلين. ختم كل قارورة وتخزينها في -20 درجة مئوية. يجب إذابة Aliquots مرة واحدة فقط. حذار من تكثيف الماء داخل الثلاجة. الببتيدات في حل تتحلل بسهولة بالغة.
Oligomerization
لقد بدأت قبل الحصول على استعداد :
- Aβ 1-42 / DMSO (5mM)
- الفوسفات العقيمة العازلة
- منخفضة ملزم أنابيب البولي بروبلين microcentrifuge (1.5 مل)
- منخفضة ملزم أنابيب البولي بروبلين الطرد المركزي (50 مل)
- تمييع Aβ الحصول 5mM 1-42 / DMSO قسامة مع العازلة الفوسفات العقيمة (تصل إلى 100 ميكرولتر).
- دوامة لمدة 30 ثانية ثم احتضان لمدة 12 ساعة في 4 درجات مئوية
الحصين شريحة العلاج
عند معالجة شرائح الحصين ، فمن المهم لتجنب التصاق غير محددة الببتيد على الأكواب ، والأسطح أنابيب التروية ، وغرفة تسجيل. استخدام تفضيلي منخفض ملزمة أنابيب البولي بروبيلين والحاويات. تجنب استخدام الأواني الزجاجية أو البلاستيكية عامة وير. وينبغي أن تكون وسائل الاعلام نضح المصل أو الزلال الحرة.
Aβ نضح
لقد بدأت قبل الحصول على استعداد :
- Oligomerized Aβ 1-42
- تسجيل العازلة (مم : 124 كلوريد الصوديوم ، 4.4 بوكل ، 1 نا 2 هبو 4 ، 25 NaHCO 3 ، 2 CaCl 2 ، 2 MgCl 2 ، والجلوكوز 10)
- الكهربية تسجيل انشاء غرفة مع واجهة
- الحصين شرائح عرضية المحتضنة في المخزن المؤقت لتسجيل الاوكسيجين 90 دقيقة على الأقل في مرحلة ما بعد تشريح (T = 29 درجة مئوية ، معدل ثابت نضح = 2 مل / دقيقة)
- على الفور قبل التجربة ، وتمييع Aβ oligomerized 1-42 قسامة لتركيز العمل المناسبة (200 نيوتن متر أو أعلى) في أنبوب البولي بروبلين العازلة مع تسجيل قبل الاوكسيجين.
- ويروي Aβ 1-42 حل لمدة 20 دقيقة لشرائح قبل تحريض اللدونة متشابك.
تحريض اللدونة والمتابعة
- عادة ، النموذج الأكثر استخداما على نطاق واسع من المرونة متشابك هو الكمونية. يمكن أن يتسبب ذلك من خلال تحفيز كزازي من المشبك معينة في قرن آمون. نسجل الردود الحقل من نقاط الاشتباك العصبي بين التوقعات والضمانات شافير والخلايا العصبية CA1 الهرمية في الطبقة المشععة. التحفيز لدينا كزازي يتكون من تحفيز انفجار ثيتا التي تضم 3 قطارات مفصولة فترات 15 ثانية. كل قطار يتكون من 10 طلقات نارية عند 5 هرتز حيث انفجر يستتبع كل 5 نبضات عند 100 هرتز. تطبيق التحفيز كزازي مباشرة بعد انتهائه ، نضح من Aβ oligomerized.
- مباشرة بعد التحفيز كزازي التبديل إلى نضح مع تسجيل عازلة طبيعية. الحفاظ على معدل ثابت التروية ، وتسجيل درجة حرارة الغرفة والأوكسجين المناسبة طوال فترة التجربة.
ممثل النتائج والمشاكل المحتملة
وAβ oligomerized وفقا لبروتوكول الكلاسيكية ستاين وآخرون كول 1 ، يولد مونومرات Aβ ومجموعة متنوعة من oligomers من أحجام مختلفةق (ديمر ، ترايمر ، الخ) ونضح من oligomerized Aβ 1-42 يؤدي إلى تناقص في LTP Aβ شرائح المعالجة مقارنة مع شرائح السيطرة. تحت ظروف تجريبية لدينا ، حيث يتم استخدام 3-5 الشهر القديمة C57BL/6J الفئران الذكور ، الكمونية في 200 نانومتر Aβ شرائح المعالجة على 150 ٪ من متوسط القيم الأساسية في ساعتين بعد التحفيز كزازي ، في حين أن شرائح تحكم القيم والكمونية على ٪ متوسط baseline2 200-250. في بعض الحالات ، قد تفشل المعاملة مع Aβ للحد من الكمونية الحصين. أخطاء فادحة عدة التي قد تحدث تشمل الفيلم المفرطة أثناء التجفيف وتركيز Aβ oligomerization غير مكتملة. قد نضح في Aβ شرائح الحصين تكون مصدرا آخر للقلق بسبب الخصائص الفيزيائية للالببتيد Aβ في الحل ، الذي هو عرضة للالتصاق غير محددة للمواد البلاستيكية. وتناقش هذه القضايا من المشاكل أدناه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على النحو الموصوف أعلاه ، قد تحدث مشاكل عدة في إعداد Aβ oligomeric النتيجة في LTP ايتأثر. طريقة واحدة لتقييم ما إذا كان تدهور Aβ أو عدم وجود oligomerization Aβ قد حدث هو تقييم إعداد Aβ باستخدام TRIS - Tricine PAGE / تحليل الغربية التنشيف والتحليلية تنبيذ فائق (وليس وصفها في هذا البروتوكول). عندما يتم إعداد نماذج الغربية في ظل ظروف non-denaturing/non-reducing التنشيف ، وينبغي أن الإعداد الناجح إنشاء التوقيع الغربية التنشيف يضم عصابات المقابلة لمونومرات وoligomers مختلفة 3. مسألة تحدث في كثير من الأحيان هو عدم الاستقرار الببتيد خلال تجفيف خطوة في SpeedVac المكثف. في الواقع ، وارتفاع درجة حرارة التجفيف يؤدي إلى تدهور البروتين ، والملاحظ من خلال تلوين الببتيد ملحوظ مع البني. تركيز المحلول HFIP والتي ستنفذ في درجة حرارة الغرفة ورصدها بعناية. بالنظر إلى العديد من الخطوات الاجرائية التي تحدث في البروتوكول ، قد أخطاء في التخفيف يؤدي عن غير قصد oligomerization الفقراء أو مضللة تركيز Aβ. ومن المثير للاهتمام ، فإن نضح Aβ بتركيزات أقل مما اقترح في القيم نتيجة زيادة LTP 3. مرة أخرى ، نضح يؤثر على النتيجة المحتملة للعلاج Aβ على شرائح. في الواقع ، والحفاظ على درجة حرارة ثابتة من الحل في الحمام تجاربنا الكهربية أمر بالغ الأهمية كما هو معروف أن تؤثر على درجة حرارة التشكل Aβ عندما تحل في العازلة الفوسفات. مصدر آخر للقلق هو أن Aβ oligomeric يجوز لغير وجه التحديد التمسك السطوح البلاستيكية الحاويات والأنابيب المستخدمة لإعداد ونضح مما يقلل من التركيز الفعال تتعرض لشرائح الحصين. وبالتالي ، فمن الضروري استخدام المنخفضة البروتين ملزمة البلاستيك وير الاستعدادات لضمان موثوقية وperfusions طوال تجارب مختلفة. في هذه المسألة ، فإننا نقترح البولي بروبلين البلاستيكية وير الذي تبين أنه لا يؤثر على نسبة من الأنواع المختلفة Aβ 4. الأدب واسعة تشير إلى أن مرض الزهايمر ينشأ كاضطراب متشابك 5. فمن المرجح أن دقة وتنوع الأعراض المبكرة فقد الذاكرة ، والتي تحدث في غياب أي علامات سريرية أخرى من إصابات الدماغ ، ونتيجة للتغيرات في وظيفة منفصلة من المشبك واحد ، ينتج ، على الأقل جزئيا ، من جانب الأنواع Aβ ( على سبيل المثال Aβ 42 و 40 Aβ) 2،6،7،8. وقد أدى هذا الاكتشاف إلى أن إعداد تحتوي oligomerized Aβ 1-42 الاصطناعية يمكن أن يعوق LTP 9 في المختبر إلى العديد من التحقيقات في آليات الخلل الناجم عن الارتفاع متشابك Aβ في الدماغ. باستخدام هذا البروتوكول ، ونحن وصف الإجراء لإعداد Aβ oligomeric الذي ينال بنجاح الكمونية في اتصال شافير المشععة ضمانات إضافية في شرائح الطبقة الحصين. هذا النموذج التجريبي له قيمة هائلة للتحقيق في آليات Aβ بوساطة المرضية فضلا عن اختبار عقاقير محتملة ، والتي قد تخفف الخلل متشابك 2،10،11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها IACUC جامعة كولومبيا.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) (NS049442).>
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aβ 1-42 (lyophilized) | American Peptide | 62-0-80 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) | Fluka | 52517 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Biotium, Inc. | 90082 | |
| 50mL Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 05-538-67 | |
| 1.5ml MaxyClear microtubes Maximum recovery | Axygen Scientific | MCT-150-L-C | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| GASTIGHT Syringes 250 μL | Hamilton Co | 1725 | |
| Bath sonicator | Branson | 3510 | |
| Savant SpeedVac Concentrator System | Various | SC 110A |
References
- Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278, 11612-11622 (2003).
- Vitolo, O. V. Amyloid beta -peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 13217-13221 (2002).
- Puzzo, D. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. J Neurosci. 28, 14537-14545 (2008).
- Lewczuk, P. Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides. Clin Chem. 52, 332-334 (2006).
- Masliah, E. Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Histol Histopathol. 10, 509-519 (1995).
- Cullen, W. K., Suh, Y. H., Anwyl, R., Rowan, M. J. Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments. Neuroreport. 8, 3213-3217 (1997).
- Itoh, A. Impairments of long-term potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats. Eur J Pharmacol. 382, 167-175 (1999).
- Walsh, D. M. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature. 416, 535-539 (2002).
- Lambert, M. P. nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6448-6453 (1998).
- Gong, B. Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory. Cell. 126, 775-788 (2006).
- Trinchese, F. Inhibition of calpains improves memory and synaptic transmission in a mouse model of Alzheimer disease. J Clin Invest. 118, 2796-2807 (2008).
