Summary
Ett inslag i Alzheimers sjukdom är den förhöjning av A-beta
Abstract
Nedskrivningar av synapsförbindelser sannolikt ligger bakom de subtila amnesic förändringar som skett i ett tidigt skede av Alzheimers sjukdom (AD). β-amyloid (A-beta), en peptid som produceras i stora mängder i AD, är känt för att minska långsiktig potentiering (LTP), en cellulär korrelera för inlärning och minne. Faktum är LTP orsakats av A-beta ett användbart experimentell paradigm för att studera synaptisk dysfunktioner i AD modeller och för screening läkemedel som kan mildra eller återgå sådant synaptic nedskrivningar. Studier har visat att A-beta producerar LTP störningar företrädesvis via sin oligomeric form. Här har vi en detaljerad protokoll för att försämra LTP av perfusion av oligomerized syntetiska Aβ1-42 peptid på akut hippocampus skivor. I denna video, disposition vi en steg-för-steg förfarande för beredning av oligomeric A-beta
Protocol
Resuspending β-amyloid peptiden
Innan du börjar ha klart:
- A-beta 1-42 (frystorkat pulver)
- 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)
- Låg-bindande polypropylen mikrocentrifugrör (1,5 ml)
- Gastäta Hamilton spruta med Teflon störtar stop (250 l)
- Dimetylsulfoxid (DMSO)
- Låt frystorkat A-beta 1-42 utjämna till rumstemperatur i 30 minuter för att undvika kondens när du öppnar peptiden flaskan.
- Under dragskåp återsuspendera A-beta 1-42 peptid i iskallt HFIP att få en 1 mm-lösning och skaka lösningen för ett par sekunder.
- Med hjälp av ett glas gastät Hamilton spruta med teflon plugg, snabbt dela A-beta 1-42 / HFIP lösningen jämnt i tre polypropylen flaskor och förslut flaskorna.
- Flaskorna inkuberas därefter i 2 timmar för att möjliggöra A-beta monomerization. Nästa, öppna flaskor och koncentrera A-beta 1-42 / HFIP lösningen under vakuum med hjälp av en SpeedVac centrifug (800 g, rumstemperatur) tills en klar peptid film observeras på botten av flaskorna. Kontrollera noga att temperaturen inuti SpeedVac centrifugen för att undvika peptid nedbrytning (max 25 ° C).
- Förslut flaskorna och förvara alikvoter vid -80 ° C. A-beta-film kan lagras i 6 månader.
- Återsuspendera en film genom att lägga DMSO att få en koncentration upp till 5 mm A-beta 1-42. Sonikera i vattenbad i 10 minuter för att säkerställa fullständig resuspension.
- Alikvot detta 5mm A-beta 1-42 lösning i polypropylen injektionsflaskor. Täta alla flaskorna och förvara dem vid -20 ° C. Alikvoter bör endast tinas upp en gång. Se upp för kondens inne i frysen. Peptider i lösningen bryts ner mycket lätt.
Oligomerisering
Innan du börjar ha klart:
- A-beta 1-42 / DMSO (5mm)
- Sterila fosfatbuffert
- Låg-bindande polypropylen mikrocentrifugrör (1,5 ml)
- Låg-bindande polypropylen centrifugrör (50 ml)
- Späd det erhållna 5 mm A-beta 1-42 / DMSO alikvot med steril fosfatbuffert (upp till 100 l).
- Vortexa i 30 sekunder och sedan inkubera i 12 timmar vid 4 ° C
Hippocampus skiva behandling
Vid behandling av hippocampus skivor, är det viktigt att undvika icke-specifik peptid vidhäftning på bägare, perfusion ytor slang, och inspelningen kammaren. Använd företrädesvis låg-bindande polypropylen slang och behållare. Undvik att använda glas eller generiska plast-ware. Perfusion medier bör serum-eller albumin-fri.
A-beta-perfusion
Innan du börjar ha klart:
- Oligomerized A-beta 1-42
- Inspelning buffert (i mm: 124 NaCl, 4,4 KCl, 1 Na 2 HPO 4, 25 NaHCO 3, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2 och 10 glukos)
- Elektrofysiologiska inspelning ställa upp med gränssnitt kammare
- Tvärgående hippocampus skivor inkuberas i syresatt inspelning buffert i minst 90 minuter efter dissektion (T = 29 ° C, konstant perfusionshastighet = 2 ml / minut)
- Omedelbart före experimentet, späd oligomerized A-beta 1-42 alikvot till lämpliga arbetsvillkor koncentrationen (200 nm eller högre) i en polypropylen rör med pre-syresatt inspelning buffert.
- BEGJUTA A-beta 1-42 lösningen i 20 minuter till skivor innan induktion av synaptisk plasticitet.
Induktion av plasticitet och uppföljning
- Normalt är det mest använda modellen av synaptisk plasticitet i LTP. Det kan induceras genom tetanic stimulering av en viss synaps i hippocampus. Vi fält svar från synapser mellan Shaffer säkerheter prognoser och CA1 pyramidala nervceller i stratum radiatum. Vår tetanic stimulering består av en theta burst stimulering som innehåller 3 tåg separeras med 15 sekunders intervall. Varje tåg består av 10 brister vid 5 Hz där varje burst innebär 5 pulser vid 100 Hz. Applicera tetanic stimuleringen direkt efter perfusionen i oligomerized A-beta har slutförts.
- Omedelbart efter tetanic stimulering gå tillbaka till perfusion med normal inspelning buffert. Hålla en konstant perfusionshastighet, inspelning kammare temperatur och ordentlig syresättning under hela experimentet.
Representativa resultat och eventuella problem
A-beta oligomerized enligt den klassiska protokollet av Stine et Coll. 1, genererar A-beta-monomerer och en mängd av oligomerer av olika storleks (dimer, trimer, etc.) perfusion av oligomerized A-beta 1-42 leder till minskad LTP i A-beta-behandlade skivor jämfört med kontroll skivor. Enligt vår experimentella förhållanden, där 3-5 månader gamla C57BL/6J hanmöss används, LTP i 200 nm A-beta-behandlade skivor är i genomsnitt 150% av de utgångsvärden vid två timmar efter tetanic stimulering, medan kontrollen skivor LTP värden i genomsnitt 200-250% av baseline2. I vissa fall kan behandling med A-beta misslyckas med att minska hippocampus LTP. Flera kritiska fel som kan uppstå innehålla alltför film torkning under A-beta-koncentration och ofullständig oligomerisering. A-beta-perfusion i hippocampus skivor kan vara en annan källa till oro på grund av fysikalisk-kemiska egenskaper A-beta-peptiden i lösning, som är utsatt för icke-specifik vidhäftning till plaster. Felsökning av dessa frågor diskuteras nedan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som beskrivits ovan kan flera problem i beredningen av oligomeric A-beta leder felfri LTP. Ett sätt att utvärdera om A-beta nedbrytning eller brist på A-beta oligomerisering kan ha uppstått är att utvärdera A-beta-preparatet hjälp av tris-Tricine SIDA / Western blotting analys och analytisk ultracentrifugering (som inte beskrivs i detta protokoll). När Western blotting provföremålen i non-denaturing/non-reducing villkor, bör en lyckad förberedelse generera en Western blotting signatur med banden som motsvarar monomerer och olika oligomerer 3. En ofta förekommande fråga är peptiden instabiliteten under torkningen steg i SpeedVac anrikningsverk. I själva verket leder hög temperatur torkning till proteinnedbrytning, märks genom märkta peptid färg till brunt. Koncentration av HFIP lösning måste utföras vid rumstemperatur och övervakas noggrant. Eftersom flera steg i förfarandet som förekommer i protokollet, får fel i utspädning leder misstag till dålig oligomerisering eller missvisande A-beta-koncentration. Intressant skulle perfusion med A-beta-koncentrationer som är lägre än vad som föreslås leda till ökad LTP värden 3. Återigen påverkar perfusionen det möjliga resultatet av A-beta-behandling på skivor. Faktum är att upprätthålla en konstant temperatur på badet lösningen i vår elektrofysiologiska experimenten är viktigt eftersom temperaturen är känd för att påverka A-beta-konformationer då löst i fosfatbuffert. En annan källa till oro är att oligomeric A-beta kan ospecifikt fastnar på plastytor av behållare och slang som används för beredning och perfusion och därmed minska den effektiva koncentrationen utsätts för hippocampus skivor. Därför är det viktigt att använda med låg proteinbindning plast-ware för att säkerställa tillförlitlig förberedelser och perfusion under olika experiment. I det här numret föreslår vi propenplast-ware som har visat sig påverka förhållandet mellan olika A-beta-arter 4. Omfattande litteratur visar att Alzheimers sjukdom har sitt ursprung som en synaptisk sjukdom 5. Det är troligt att den subtila och variationen av de tidigaste amnesic symtom, förekommer i avsaknad av andra kliniska tecken på hjärnskada, beror på diskreta förändringar i funktionen av en enda synaps, produceras åtminstone delvis, av A-beta-art ( t.ex. A-beta-42 och A-beta-40) 2,6,7,8. Upptäckten att en beredning som innehåller oligomerized syntetiska A-beta 1-42 kan försämra LTP 9 in vitro har lett till många utredningar av mekanismer för synaptisk dysfunktion orsakad av A-beta-förhöjning i hjärnan. Med hjälp av detta protokoll, beskriver vi en ordning för beredning oligomeric A-beta som framgångsrikt försämrar LTP på Shaffer säkerheter-stratum radiatum anslutning i hippocampus skivor. Denna experimentella paradigm är oerhört värdefull för att undersöka mekanismerna för A-beta-medierad patogenes samt testa potentiella läkemedel som kan lindra synaptisk dysfunktion 2,10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av Columbia University IACUC.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke (NINDS) (NS049442).>
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aβ 1-42 (lyophilized) | American Peptide | 62-0-80 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) | Fluka | 52517 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Biotium, Inc. | 90082 | |
| 50mL Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 05-538-67 | |
| 1.5ml MaxyClear microtubes Maximum recovery | Axygen Scientific | MCT-150-L-C | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| GASTIGHT Syringes 250 μL | Hamilton Co | 1725 | |
| Bath sonicator | Branson | 3510 | |
| Savant SpeedVac Concentrator System | Various | SC 110A |
References
- Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278, 11612-11622 (2003).
- Vitolo, O. V. Amyloid beta -peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 13217-13221 (2002).
- Puzzo, D. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. J Neurosci. 28, 14537-14545 (2008).
- Lewczuk, P. Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides. Clin Chem. 52, 332-334 (2006).
- Masliah, E. Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Histol Histopathol. 10, 509-519 (1995).
- Cullen, W. K., Suh, Y. H., Anwyl, R., Rowan, M. J. Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments. Neuroreport. 8, 3213-3217 (1997).
- Itoh, A. Impairments of long-term potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats. Eur J Pharmacol. 382, 167-175 (1999).
- Walsh, D. M. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature. 416, 535-539 (2002).
- Lambert, M. P. nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6448-6453 (1998).
- Gong, B. Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory. Cell. 126, 775-788 (2006).
- Trinchese, F. Inhibition of calpains improves memory and synaptic transmission in a mouse model of Alzheimer disease. J Clin Invest. 118, 2796-2807 (2008).
