Summary
अल्जाइमर रोग की एक विशेषता Aβ की पदोन्नति है
Abstract
Synaptic कनेक्शन की हानि सूक्ष्म amnesic अल्जाइमर रोग (ई.) के प्रारंभिक चरणों में होने वाली परिवर्तन आबाद होने की संभावना है. (Aβ) β-amyloid, एक पेप्टाइड ई. में उच्च मात्रा में उत्पादित, दीर्घकालिक potentiation (LTP), सीखने और स्मृति के एक सेलुलर सहसंबंधी को कम करने के लिए जाना जाता है. दरअसल, LTP Aβ द्वारा कारण हानि ई. मॉडल में और स्क्रीनिंग कम करने या लौटना ऐसे synaptic impairments के सक्षम दवाओं के लिए synaptic dysfunctions के अध्ययन के लिए एक उपयोगी प्रयोगात्मक प्रतिमान है. अध्ययनों से पता चला है कि Aβ अपनी oligomeric फ़ॉर्म के द्वारा LTP व्यवधान preferentially उत्पादन. यहाँ हम oligomerized सिंथेटिक के छिड़काव से आई. LTP के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल तीव्र hippocampal स्लाइस पर Aβ1-42 पेप्टाइड प्रदान. इस वीडियो में, हम oligomeric Aβ की तैयारी के लिए एक कदम दर कदम प्रक्रिया की रूपरेखा
Protocol
Resuspending पेप्टाइड β-amyloid
पहले शुरू हो रही तैयार है:
- Aβ 1-42 (lyophilized पाउडर)
- 1,1,1,3,3,3 - Hexafluoro-2-propanol (HFIP)
- कम बाध्यकारी polypropylene microcentrifuge ट्यूबों (1.5 मिलीलीटर)
- Teflon उतर रोक (250 μl) के साथ GasTight हैमिल्टन सिरिंज
- Dimethylsulfoxide (DMSO)
- Lyophilized 1-42 Aβ 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर संतुलित करने के लिए पेप्टाइड शीशी खोलने पर संक्षेपण से बचने के लिए अनुमति दें.
- धूआं हुड के तहत, बर्फ के ठंडे HFIP में Aβ 1-42 पेप्टाइड फिर से निलंबित करने के लिए 1 मिमी समाधान और कुछ सेकंड के लिए समाधान भंवर के प्राप्त है.
- Teflon प्लग के साथ एक गिलास GasTight हैमिल्टन सिरिंज का प्रयोग, जल्दी से तीन polypropylene शीशियों में समान रूप से Aβ समाधान 1-42 / HFIP विभाजन और शीशियों सील.
- शीशियों तो 2 घंटे के लिए incubated हैं Aβ monomerization के लिए अनुमति देने के लिए. अगला, शीशियों को खोलने के लिए और वैक्यूम के तहत एक स्पष्ट पेप्टाइड फिल्म शीशियों के नीचे में मनाया जाता है जब तक एक SpeedVac अपकेंद्रित्र (800 ग्राम, कमरे के तापमान) का उपयोग करके Aβ 1-42 HFIP / समाधान केंद्रित. सावधानी SpeedVac अपकेंद्रित्र के भीतर का तापमान की जाँच पेप्टाइड गिरावट से बचने के (अधिकतम सी 25 °).
- शीशियों को सील करने और -80 पर aliquots दुकान डिग्री सेल्सियस Aβ फिल्म 6 महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है.
- 5 मिमी Aβ 1-42 एकाग्रता प्राप्त DMSO जोड़ने के द्वारा एक फिल्म पुनः निलंबित . 10 मिनट के लिए पानी के स्नान में Sonicate फिर निलंबन को पूरा सुनिश्चित करने के लिए.
- Polypropylene शीशियों में विभाज्य इस 5mm Aβ 1-42 समाधान. सभी शीशियों को सील करने और उन्हें -20 ° सी. पर दुकान Aliquots केवल एक बार thawed किया जाना चाहिए. फ्रीजर के अंदर पानी संक्षेपण के खबरदार. समाधान में पेप्टाइड्स बहुत आसानी से नीचा.
Oligomerization
पहले शुरू हो रही तैयार है:
- 1-42 Aβ / DMSO (5mm)
- बाँझ फॉस्फेट बफर
- कम बाध्यकारी polypropylene microcentrifuge ट्यूबों (1.5 मिलीलीटर)
- कम बाध्यकारी polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब (50 मिलीलीटर)
- प्राप्त 5mm 1-42 Aβ / बाँझ फॉस्फेट बफर (100 μl) के साथ DMSO विभाज्य पतला .
- 30 सेकंड के लिए भंवर और फिर 4 पर 12 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
Hippocampal टुकड़ा उपचार
जब hippocampal स्लाइस इलाज, यह महत्वपूर्ण है गैर विशिष्ट beakers, छिड़काव टयूबिंग सतहों, और रिकॉर्डिंग कक्ष पर पेप्टाइड आसंजन से बचने के. Preferentially कम बाध्यकारी polypropylene टयूबिंग और कंटेनरों का प्रयोग करें. कांच के बने पदार्थ या जेनेरिक प्लास्टिक के बर्तन के उपयोग से बचें. छिड़काव मीडिया सीरम या albumin से मुक्त होना चाहिए.
Aβ छिड़काव
पहले शुरू हो रही तैयार है:
- Oligomerized 1-42 Aβ
- रिकॉर्डिंग बफर (मिमी में 124 NaCl, 4.4 KCl, 1 ना 2 4 HPO, 25 NaHCO 3, 2 2 CaCl, 2 2 MgCl, और 10 ग्लूकोज)
- इंटरफ़ेस चैम्बर के साथ electrophysiological रिकॉर्डिंग सेट अप
- ट्रांसवर्स hippocampal - विच्छेदन के बाद कम से कम 90 मिनट के लिए oxygenated रिकॉर्डिंग बफर में incubated स्लाइस (= टी 29 डिग्री सेल्सियस, लगातार छिड़काव दर = 2 मिलीग्राम / मिनट)
- तुरंत पहले प्रयोग के लिए पूर्व oxygenated रिकॉर्डिंग बफर के साथ एक polypropylene ट्यूब में उचित काम कर रहे एकाग्रता (200 एनएम या अधिक) oligomerized Aβ 1-42 विभाज्य पतला .
- Synaptic plasticity की प्रेरण से पहले स्लाइस के लिए 20 मिनट के लिए Aβ 1-42 समाधान Perfuse.
Plasticity की प्रेरण और अप का पालन करें
- आमतौर पर, synaptic plasticity के सबसे व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता मॉडल LTP है. यह हिप्पोकैम्पस में एक भी synapse के धनुस्तंभीय उत्तेजना के माध्यम से प्रेरित किया जा सकता है. हम Shaffer संपार्श्विक अनुमानों और परत radiatum में CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स के बीच synapses से क्षेत्र प्रतिक्रियाओं का रिकॉर्ड है. हमारी धनुस्तंभीय उत्तेजना थीटा फट उत्तेजना है जो 3 15 सेकंड के अंतराल के द्वारा अलग गाड़ियों शामिल होते हैं. प्रत्येक रेलगाड़ी 5 हर्ट्ज है जहां प्रत्येक फट 100 हर्ट्ज पर 5 दालों जरूरत पर जोर देता है पर 10 फटने के होते हैं. धनुस्तंभीय उत्तेजना oligomerized Aβ के छिड़काव के तुरंत बाद पूरा हो गया है लागू करें.
- तुरंत बाद धनुस्तंभीय उत्तेजना सामान्य रिकॉर्डिंग बफर के साथ छिड़काव के लिए वापस स्विच. एक निरंतर छिड़काव दर, रिकार्डिंग कक्ष तापमान प्रयोग की अवधि के दौरान और उचित oxygenation बनाए रखें.
प्रतिनिधि परिणाम और संभावित समस्याओं
Aβ Stine एट coll के शास्त्रीय प्रोटोकॉल 1. अनुसार oligomerized Aβ monomers और विभिन्न आकार के oligomers की एक किस्म उत्पन्न(डिमर, trimer, आदि) oligomerized के छिड़काव Aβ कमी आई Aβ इलाज स्लाइस में नियंत्रण स्लाइस की तुलना में LTP करने के लिए 1-42 सुराग . हमारे प्रयोगात्मक शर्तों, जहां 3-5 महीने पुराने C57BL/6J नर चूहों का इस्तेमाल किया जाता है के तहत, LTP 200 एनएम में Aβ-इलाज स्लाइस धनुस्तंभीय उत्तेजना के बाद दो घंटे में आधारभूत मूल्यों के औसत 150% पर है, जबकि नियंत्रण स्लाइस में LTP मान रहे हैं baseline2 का औसत 200-250% पर. कुछ मामलों में, Aβ के साथ इलाज hippocampal LTP को कम करने में विफल हो सकता है. कई महत्वपूर्ण त्रुटियाँ है कि हो सकता है अत्यधिक Aβ एकाग्रता और अधूरा oligomerization के दौरान सुखाने फिल्म शामिल हैं. Hippocampal स्लाइस में Aβ छिड़काव समाधान में Aβ पेप्टाइड, जो गैर विशिष्ट प्लास्टिक आसंजन के लिए प्रवण है की भौतिक गुणों की वजह से चिंता का एक अन्य स्रोत हो सकता है. इन मुद्दों का समस्या निवारण नीचे चर्चा है.
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Discussion
जैसा कि ऊपर वर्णित है, oligomeric Aβ की तैयारी में कई समस्याओं अछूता LTP में परिणाम कर सकते हैं. एक ही रास्ता करने के लिए मूल्यांकन कि Aβ गिरावट या Aβ oligomerization की कमी हुई हो सकती है है Aβ Tris Tricine PAGE / पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण और विश्लेषणात्मक ultracentrifugation (इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं) का उपयोग कर तैयारी का मूल्यांकन है. जब पश्चिमी सोख्ता नमूने non-denaturing/non-reducing शर्तों के तहत तैयार हैं, एक सफल तैयारी एक पश्चिमी सोख्ता monomers और विभिन्न oligomers 3 करने के लिए इसी बैंड की विशेषता हस्ताक्षर उत्पन्न करनी चाहिए. एक मुद्दा अक्सर होने वाली SpeedVac concentrator में सुखाने कदम के दौरान पेप्टाइड अस्थिरता है. वास्तव में, उच्च तापमान सुखाने प्रोटीन गिरावट की ओर जाता है है, भूरे रंग के लिए चिह्नित पेप्टाइड रंगाई द्वारा ध्यान देने योग्य है. HFIP समाधान की एकाग्रता बाहर कमरे के तापमान पर किया जा निगरानी और ध्यान से है. कई प्रक्रियात्मक चरणों का प्रोटोकॉल में होने वाली को देखते हुए, कमजोर पड़ने में त्रुटियों को गलती से गरीब oligomerization या भ्रामक Aβ एकाग्रता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. दिलचस्प है, Aβ की तुलना में सुझाव दिया कम सांद्रता के साथ छिड़काव वृद्धि हुई LTP मूल्यों में 3 नतीजा होगा . फिर, छिड़काव स्लाइस पर Aβ उपचार के संभावित परिणाम को प्रभावित करता है. दरअसल, हमारे electrophysiological प्रयोगों में स्नान समाधान की एक निरंतर तापमान बनाए रखने के महत्वपूर्ण के रूप में तापमान Aβ रचना प्रभावित जब फॉस्फेट बफर में हल करने के लिए जाना जाता है है. चिंता का एक अन्य स्रोत है कि oligomeric Aβ गैर विशेष रूप से प्लास्टिक कंटेनर और टयूबिंग तैयारी और छिड़काव जिससे प्रभावी hippocampal स्लाइस को उजागर एकाग्रता को कम करने के लिए इस्तेमाल किया सतहों के लिए छड़ी कर सकते हैं. इस प्रकार, यह कम प्रोटीन बाध्यकारी प्लास्टिक के बर्तन का उपयोग करने के लिए विश्वसनीय और विभिन्न प्रयोगों के दौरान तैयारी perfusions सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस अंक में, हम प्लास्टिक के बर्तन polypropylene जो अलग Aβ 4 प्रजातियों के अनुपात को प्रभावित नहीं दिखाया गया है प्रस्ताव है. व्यापक साहित्य से पता चलता है कि अल्जाइमर रोग एक synaptic 5 विकार के रूप में originates. यह संभावना है कि सूक्ष्मता और जल्द से जल्द amnesic लक्षण की परिवर्तनशीलता, मस्तिष्क की चोट के किसी भी अन्य नैदानिक लक्षण के अभाव में होने वाली है, एक एकल synapse के समारोह में असतत परिवर्तन, भाग में कम से कम Aβ प्रजातियों द्वारा उत्पादित, की वजह से कर रहे हैं ( जैसे Aβ 42 और 40 Aβ) 2,6,7,8. खोज की है कि एक तैयारी oligomerized सिंथेटिक 1-42 Aβ युक्त इन विट्रो में 9 LTP ख़राब कर सकते हैं मस्तिष्क में Aβ ऊंचाई से प्रेरित synaptic रोग के तंत्र में कई जांच के लिए नेतृत्व किया गया है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम जो सफलतापूर्वक Shaffer संपार्श्विक - परत hippocampal स्लाइस में radiatum कनेक्शन पर LTP impairs oligomeric Aβ तैयार करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. यह प्रयोगात्मक प्रतिमान Aβ की मध्यस्थता रोगजनन के तंत्र की जांच के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संभावित दवाओं, जो synaptic शिथिलता 2,10,11 को कम करने के सकता है परीक्षण के लिए भारी कीमत है.
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Disclosures
जानवरों पर प्रयोग कोलंबिया विश्वविद्यालय IACUC द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Acknowledgments
इस काम स्नायविक विकारों और स्ट्रोक के NIH राष्ट्रीय संस्थान (NINDS) (NS049442) द्वारा समर्थित किया गया.>
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aβ 1-42 (lyophilized) | American Peptide | 62-0-80 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) | Fluka | 52517 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Biotium, Inc. | 90082 | |
| 50mL Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 05-538-67 | |
| 1.5ml MaxyClear microtubes Maximum recovery | Axygen Scientific | MCT-150-L-C | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| GASTIGHT Syringes 250 μL | Hamilton Co | 1725 | |
| Bath sonicator | Branson | 3510 | |
| Savant SpeedVac Concentrator System | Various | SC 110A |
References
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