Summary
Una de las características de la enfermedad de Alzheimer es la elevación de Aß
Abstract
Deterioro de las conexiones sinápticas es probable que subyacen a los cambios sutiles que ocurren amnésico en las primeras etapas de la enfermedad de Alzheimer s (AD). β-amiloide (Aß), un péptido producido en grandes cantidades en el año, se sabe que reduce potenciación a largo plazo (LTP), un celular correlato de aprendizaje y la memoria. De hecho, el deterioro causado por Aß LTP es un paradigma útil experimental para el estudio de las disfunciones sináptica en modelos de AD y de detección de drogas capaces de mitigar o revertir tales alteraciones sinápticas. Los estudios han demostrado que Aß produce la interrupción de LTP preferentemente a través de su forma oligomérica. Aquí les ofrecemos un protocolo detallado para la LTP impedir en la perfusión de oligomerized sintéticos Aβ1-42 péptido en agudas rodajas de hipocampo. En este video, se describe un procedimiento paso a paso para la preparación de Aß oligoméricos
Protocol
Resuspensión de β-amiloide
Antes de empezar se han preparado:
- Aß 1-42 (polvo liofilizado)
- 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)
- Baja unión a tubos de polipropileno de microcentrífuga (1,5 ml)
- Herméticas Hamilton jeringa con parada caída de teflón (250 l)
- Dimetilsulfóxido (DMSO)
- Permitir Aß 1-42 liofilizado para equilibrar a temperatura ambiente durante 30 minutos para evitar la condensación al abrir el vial de péptidos.
- Bajo la campana extractora de humos, una nueva suspensión Aß 1-42 péptido en HFIP fría para obtener una solución 1 mM y agitar la solución durante unos segundos.
- El uso de un cristal hermético jeringa Hamilton con enchufe de teflón, se dividen rápidamente el Aß 1-42 / HFIP solución igualmente en tres viales de polipropileno y el sello de los viales.
- Los viales se incuban durante 2 horas para permitir monomerización Aß. A continuación, abra los viales y concentrar la solución de Aß 1-42 / HFIP al vacío mediante el uso de una centrifugadora SpeedVac (800 g, la temperatura ambiente) hasta que una película péptido claro se observa en la parte inferior de los viales. Compruebe cuidadosamente la temperatura dentro de la centrifugadora SpeedVac para evitar la degradación de péptidos (máximo 25 ° C).
- Sello de los viales y almacenar las alícuotas a -80 ° C. Aß película se puede almacenar durante 6 meses.
- Vuelva a suspender una película mediante la adición de DMSO para obtener una concentración de hasta 5 mm Aß 1-42. Sonicado en el baño de agua durante 10 minutos para asegurar la resuspensión completa.
- Alícuota de este Aß 5mM 1-42 solución en viales de polipropileno. Sello de todos los viales y almacenarlos a -20 ° C. Alícuotas deben descongelarse sólo una vez. Cuidado con la condensación de agua en el interior del congelador. Péptidos en solución se degradan muy fácilmente.
Oligomerización
Antes de empezar se han preparado:
- Aß 1-42 / DMSO (5 mM)
- Tampón fosfato estéril
- Baja unión a tubos de polipropileno de microcentrífuga (1,5 ml)
- Baja unión a tubos de polipropileno centrifugadora (50 ml)
- Diluir el Aß obtenido 5mM 1-42 / alícuota DMSO con el tampón fosfato estéril (hasta 100 l).
- Vortex durante 30 segundos y luego se incuban durante 12 horas a 4 ° C
Tratamiento de corte del hipocampo
En el tratamiento de rodajas de hipocampo, que es importante para evitar la adhesión no específica péptido en vasos de precipitados, tubos de superficies de perfusión, y la cámara de grabación. Usar preferentemente bajo tubo de polipropileno de unión y contenedores. Evite el uso de material de vidrio o de plástico genérico-ware. Los medios de comunicación de perfusión debe ser suero o albúmina libre.
Perfusión Aß
Antes de empezar se han preparado:
- Oligomerized Aß 1-42
- Búfer de grabación (en mm: 124 NaCl, 4,4 KCl, 1 de Na 2 HPO 4, 25 NaHCO 3, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, y la glucosa en 10)
- Registro electrofisiológico de configuración con la interfaz de la cámara
- Transversal rodajas de hipocampo incubadas en buffer de grabación oxigenada por lo menos 90 minutos después de la disección (T = 29 ° C, velocidad de perfusión constante = 2 ml / minuto)
- Inmediatamente antes del experimento, se diluye la Aß oligomerized 1-42 alícuota a la concentración de trabajo adecuado (200 nm o superior) en un tubo de polipropileno con buffer de pre-grabación oxigenada.
- Perfundir el Aß 1-42 solución durante 20 minutos para los cortes antes de la inducción de la plasticidad sináptica.
La inducción de la plasticidad y el seguimiento
- Por lo general, el modelo más utilizado de la plasticidad sináptica es la LTP. Puede ser inducida a través de la estimulación tetánica de una sinapsis dada en el hipocampo. Nosotros registramos las respuestas de campo de las sinapsis entre las proyecciones de la garantía de Shaffer y las neuronas piramidales CA1 en el radiatum estrato. Nuestra estimulación tetánica consiste en una estimulación theta ráfaga, que incluye tres trenes separados por intervalos de 15 segundos. Cada tren se compone de 10 ráfagas a 5 Hz, donde cada ráfaga implica 5 pulsos a 100 Hz. Aplicar la estimulación tetánica inmediatamente después de la perfusión de Aß oligomerized se ha completado.
- Inmediatamente después de la estimulación tetánica volver a la perfusión con buffer de grabación normal. Mantener una velocidad de perfusión constante, temperatura de la cámara de grabación y la oxigenación adecuada durante toda la duración del experimento.
Los resultados representativos y los posibles problemas
El Aß oligomerized acuerdo con el protocolo clásico de Stine et coll. 1, genera monómeros Aß y una variedad de oligómeros de diferente tamaños (dímero, trímero, etc) La perfusión de oligomerized Aß 1-42 conduce a la disminución de LTP en Aß tratados con rebanadas en comparación con rodajas de control. Bajo condiciones experimentales, en 3-5 meses de edad, los ratones macho C57BL/6J se utilizan, LTP en 200 nM Aß tratados con rebanadas es un promedio de 150% de los valores basales a las dos horas después de la estimulación tetánica, mientras que en las rebanadas de control de los valores LTP se un promedio de 200 a 250% de baseline2. En algunos casos, el tratamiento con Aß podría no reducir la LTP hipocampal. Varios errores graves que pueden ocurrir incluyen la excesiva película de secado durante la concentración de Aß y oligomerización incompleta. Perfusión de Aß en rodajas de hipocampo podría ser otra fuente de preocupación debido a las propiedades fisicoquímicas del péptido Aß en la solución, que es propenso a la adhesión no específica a los plásticos. Solución de problemas de estos temas se discuten a continuación.
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Discussion
Como se describió anteriormente, existen varios problemas en la preparación de Aß oligoméricas pueden dar lugar a LTP intacta. Una forma de evaluar si la degradación de Aß o la falta de oligomerización Aß pudo haber ocurrido es evaluar la preparación de Aß con TRIS-Tricina PÁGINA / análisis de Western Blot y ultracentrifugación analítica (no se describe en este protocolo). Cuando Western Blotting muestras se preparan en condiciones non-denaturing/non-reducing, una preparación exitosa debe generar una firma Western Blot con las bandas correspondientes a los monómeros y oligómeros diferentes 3. Una cuestión que a menudo ocurre es la inestabilidad de péptidos durante la etapa de secado en la planta concentradora SpeedVac. De hecho, el secado a alta temperatura conduce a la degradación de proteínas, notable por la coloración del péptido marcado con color marrón. Concentración de la solución de HFIP ha de llevarse a cabo a temperatura ambiente y cuidadosamente monitoreado. Teniendo en cuenta las diversas etapas procesales que ocurren en el protocolo, los errores en la dilución accidental puede conducir a la oligomerización pobres o la concentración de Aß engañosa. Curiosamente, la perfusión con concentraciones inferiores a Aß sugerido como resultado valores LTP aumentó 3. Una vez más, la perfusión afecta a los posibles resultados del tratamiento de Aß en rodajas. De hecho, mantener una temperatura constante de la solución del baño en nuestros experimentos electrofisiológicos es crítico ya que la temperatura se sabe que afecta conformaciones Aß cuando resolvió en tampón fosfato. Otra fuente de preocupación es que Aß oligoméricas pueden no específica se adhieren a las superficies de plástico de los envases y tubos utilizados para la preparación de la perfusión y reduciendo así la concentración efectiva expuestos a cortes de hipocampo. Por lo tanto, es fundamental para el uso de baja unión a proteínas de plástico-ware para asegurar la preparación y fiable a través de diferentes experimentos perfusiones. En esta edición, se propone plástico de polipropileno-ware que se ha demostrado que no afecta a la relación de especies diferentes Aß 4. Extensa literatura sugiere que la enfermedad de Alzheimer se origina como un trastorno sináptica 5. Es probable que la sutileza y la variabilidad de los primeros síntomas de amnesia, que se producen en ausencia de otros signos clínicos de lesión cerebral, se deben a cambios discretos en la función de una sola sinapsis, producido por lo menos en parte, por especies de Aß ( por ejemplo, Aß 42 y 40 Aß) 2,6,7,8. El descubrimiento de que un preparado que contiene Aß oligomerized sintético 1-42 puede afectar LTP 9 in vitro ha dado lugar a numerosas investigaciones sobre los mecanismos de la disfunción sináptica inducida por la elevación de Aß en el cerebro. El uso de este protocolo, se describe un procedimiento para la preparación de Aß oligoméricos que impide LTP con éxito en el Shaffer garantía de los estratos de conexión radiatum en rodajas de hipocampo. Este paradigma experimental tiene un gran valor para la investigación de los mecanismos de Aß mediada patogenia, así como las pruebas de fármacos potenciales, que pueden mitigar la disfunción sináptica 2,10,11.
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Disclosures
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el IACUC la Universidad de Columbia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) (NS049442).>
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aβ 1-42 (lyophilized) | American Peptide | 62-0-80 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) | Fluka | 52517 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Biotium, Inc. | 90082 | |
| 50mL Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 05-538-67 | |
| 1.5ml MaxyClear microtubes Maximum recovery | Axygen Scientific | MCT-150-L-C | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| GASTIGHT Syringes 250 μL | Hamilton Co | 1725 | |
| Bath sonicator | Branson | 3510 | |
| Savant SpeedVac Concentrator System | Various | SC 110A |
References
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