Summary
Uma característica da doença de Alzheimer é a elevação da Aâ
Abstract
Comprometimento de conexões sinápticas é provável que fundamentam as mudanças sutis que ocorrem amnésico nas fases iniciais da doença de Alzheimer s (AD). β-amilóide (Aâ), um peptídeo produzido em quantidades elevadas em AD, é conhecido por reduzir a potenciação de longa duração (LTP), um celular correlato de aprendizagem e memória. De fato, LTP deficiência causada por Aâ é um paradigma útil para o estudo experimental disfunções sinápticas em modelos AD e para triagem de drogas capazes de atenuar ou reverter tais deficiências sináptica. Estudos têm demonstrado que Aâ produz o rompimento LTP preferencialmente via sua forma oligomérica. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para LTP prejudicando por perfusão de oligomerized sintéticos Aβ1-42 peptídeo em aguda fatias do hipocampo. Neste vídeo, descrevemos um procedimento passo-a-passo para a preparação de Aâ oligomérica
Protocol
Ressuspensão peptídeo β-amilóide
Antes de começar tenho pronto:
- Aâ 1-42 (pó liofilizado)
- 1,1,1,3,3,3 Hexafluoro-2-Propanol (HFIP)
- Baixa ligação de polipropileno tubos de microcentrífuga (1,5 ml)
- Estanques Hamilton seringa com Teflon parar de mergulhar (250 mL)
- Dimetilsulfóxido (DMSO)
- Permitir Aâ liofilizado 1-42 para equilibrar a temperatura ambiente por 30 minutos para evitar a condensação ao abrir o frasco peptídeo.
- Sob o exaustor, re-suspender Aâ peptídeo 1-42 em HFIP gelada para obter uma solução 1 mM e vortex a solução por alguns segundos.
- Usando um vidro herméticos seringa Hamilton com plug Teflon, dividem-se rapidamente a solução 1-42 / HFIP Aâ igualmente em três frascos de polipropileno e selar os frascos.
- Os frascos são então incubadas por 2 horas para permitir monomerization Aâ. Em seguida, abra os frascos e concentrar a solução Aâ 1-42 HFIP / sob vácuo, usando uma centrífuga SpeedVac (800 g, temperatura ambiente) até um filme peptídeo claro é observado no fundo dos frascos. Verifique cuidadosamente a temperatura no interior da centrífuga SpeedVac para evitar a degradação de peptídeos (max 25 ° C).
- Vedação dos frascos e armazenar as alíquotas a -80 ° C. Aâ filme pode ser armazenado por seis meses.
- Re-suspender um filme de adição de DMSO para obter uma concentração de até 5 mM Aâ 1-42. Sonicado em banho-maria por 10 minutos para garantir a completa re-suspensão.
- Alíquota deste Aâ 5mM 1-42 solução em frascos de polipropileno. Seal todos os frascos e armazená-los a -20 ° C. Alíquotas devem ser descongeladas apenas uma vez. Cuidado com a condensação de água dentro do freezer. Peptídeos em solução degradam muito facilmente.
Oligomerização
Antes de começar tenho pronto:
- Aâ 1-42 / DMSO (5mm)
- Tampão fosfato estéril
- Baixa ligação de polipropileno tubos de microcentrífuga (1,5 ml)
- Baixa ligação de polipropileno tubos de centrífuga (50 ml)
- Diluir o Aâ obtidos 5mM 1-42 / DMSO alíquota com tampão fosfato estéril (até 100 l).
- Vortex por 30 segundos e, em seguida, incubar por 12 horas a 4 ° C
Tratamento fatia hipocampal
Ao tratar fatias do hipocampo, que é importante para evitar a não-adesão específica peptídeo em provetas, tubos de superfícies de perfusão, ea câmara de gravação. Use preferencialmente de baixa ligação tubos de polipropileno e contêineres. Evitar o uso de objectos de vidro ou de plástico genérico-ware. Media de perfusão deve ser soro-albumina ou livre.
Perfusão Aâ
Antes de começar tenho pronto:
- Oligomerized Aâ 1-42
- Buffer de gravação (em mM: NaCl 124, KCl 4,4, 1 Na 2 HPO 4, 25 NaHCO 3, 2 CaCl 2, MgCl 2 2, e 10 de glicose)
- Gravação eletrofisiológicas set-up com câmara de interface
- Transversal fatias do hipocampo incubadas em tampão de gravação oxigenado durante pelo menos 90 minutos após a dissecção (T = 29 ° C; taxa de perfusão constante = 2 ml / minuto)
- Imediatamente antes do experimento, diluir o Aâ oligomerized 1-42 alíquota para a concentração de trabalho adequadas (200 nM ou superior) em um tubo de polipropileno com pré-oxigenado buffer de gravação.
- Perfundir a solução 1-42 Aâ por 20 minutos para as fatias antes da indução da plasticidade sináptica.
Indução de plasticidade e follow-up
- Normalmente, o modelo mais amplamente utilizado da plasticidade sináptica é a LTP. Ela pode ser induzida através da estimulação tetânica de uma sinapse dada no hipocampo. Registramos respostas campo de sinapses entre projeções do Shaffer garantia e CA1 neurônios piramidais no radiatum estrato. Nosso estimulação tetânica consiste em um estímulo explosão teta que inclui três trens separados por intervalos de 15 segundos. Cada trem é composto de 10 rajadas de 5 Hz, onde cada explosão acarreta 5 pulsos de 100 Hz. Aplicar a estimulação tetânica imediatamente após a perfusão de Aâ oligomerized foi concluída.
- Imediatamente após a estimulação tetânica voltar para perfusão com tampão de gravação normal. Manter uma taxa de perfusão constante, temperatura da câmara de gravação e oxigenação adequada durante toda a duração do experimento.
Resultados representante e possíveis problemas
O Aâ oligomerized acordo com o protocolo clássico de Stine et coll. 1, gera monômeros Aâ e uma variedade de oligômeros de diferentes tamanhoss (dímero, trímero, etc) A perfusão de oligomerized Aâ 1-42 leva à LTP diminuiu em Aâ tratados com fatias comparação com fatias controle. Nas nossas condições experimentais, onde 3-5 meses de idade camundongos C57BL/6J machos são usados, LTP em 200 nM Aâ tratados com fatias está em 150% média dos valores de referência, duas horas após a estimulação tetânica, enquanto em fatias controle de valores LTP são em% média de 200-250 baseline2. Em alguns casos, o tratamento com Aâ pode falhar para reduzir LTP hipocampal. Vários erros críticos que podem ocorrer incluem filme de secagem excessiva durante a concentração Aâ e oligomerização incompleta. Perfusão Aâ em fatias do hipocampo pode ser outra fonte de preocupação por causa das propriedades físico-químicas do peptídeo Aâ em solução, que está propenso a não-específica de adesão aos plásticos. Solução de problemas destas questões é discutido abaixo.
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Discussion
Como descrito acima, vários problemas na preparação de Aâ oligomérica pode resultar em LTP intacta. Uma maneira de avaliar se a degradação Aâ ou a falta de oligomerização Aâ pode ter ocorrido é o de avaliar a preparação Aâ usando TRIS-tricine PAGE / análise de Western Blotting e ultracentrifugação analítica (não descritos neste protocolo). Quando ocidental Blotting amostras são preparadas em condições non-denaturing/non-reducing, uma preparação bem sucedida deve gerar uma assinatura Western Blotting com bandas correspondentes a monômeros e oligômeros de diferentes 3. Uma questão freqüentemente ocorrendo é a instabilidade peptídeo durante a etapa de secagem ao concentrador SpeedVac. Na verdade, alta temperatura de secagem leva a degradação protéica, perceptível pela coloração peptídeo marcado para castanho. Concentração da solução HFIP tem que ser realizado à temperatura ambiente e cuidadosamente monitorizados. Dadas as várias etapas processuais que ocorrem no protocolo, os erros na diluição pode acidentalmente levar a oligomerização pobres ou concentração Aâ enganosa. Curiosamente, a perfusão com concentrações inferiores Aâ sugeriu que resultaria em valores LTP aumentou 3. Novamente, a perfusão afeta o resultado possível de tratamento Aâ em fatias. Na verdade, manter uma temperatura constante da solução de banho em nossos experimentos eletrofisiológicos é fundamental como a temperatura é conhecido por afetar conformações Aâ quando resolvidos em tampão fosfato. Outra fonte de preocupação é que Aâ oligomérica pode não especificamente aderir a superfícies de plástico de embalagens e os tubos usados para a preparação e perfusão, reduzindo assim a concentração efectiva expostos a fatias do hipocampo. Assim, é fundamental usar de baixa proteína de ligação de plástico-ware para garantir preparações confiável e perfusões todo experimentos diferentes. Nesta edição, propomos plástico polipropileno-ware que tem sido demonstrado não afetar a relação de espécies diferentes Aâ 4. Extensa literatura sugere que a doença de Alzheimer tem origem como um distúrbio sináptica 5. É provável que a sutileza ea variabilidade dos primeiros sintomas amnésicos, ocorrendo na ausência de outros sinais clínicos de lesão cerebral, são devido a alterações discretas na função de uma única sinapse, pelo menos em parte, por espécies Aâ ( por exemplo, Aâ 42 e Aâ 40) 2,6,7,8. A descoberta de que uma preparação contendo oligomerized Aâ sintético 1-42 pode prejudicar a LTP 9 in vitro tem levado a inúmeras investigações em mecanismos de disfunção sináptica induzida pela elevação Aâ no cérebro. Usando este protocolo, descrevemos um procedimento para elaborar Aâ oligoméricos que prejudica a LTP sucesso na conexão Shaffer radiatum garantia-estrato em fatias do hipocampo. Este paradigma experimental tem um enorme valor para a investigação de mecanismos de Aâ mediada patogênese, bem como testes de medicamentos em potencial, que possam atenuar disfunção sináptica 2,10,11.
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Disclosures
Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Universidade Columbia IACUC.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS049442).>
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aβ 1-42 (lyophilized) | American Peptide | 62-0-80 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) | Fluka | 52517 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Biotium, Inc. | 90082 | |
| 50mL Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 05-538-67 | |
| 1.5ml MaxyClear microtubes Maximum recovery | Axygen Scientific | MCT-150-L-C | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| GASTIGHT Syringes 250 μL | Hamilton Co | 1725 | |
| Bath sonicator | Branson | 3510 | |
| Savant SpeedVac Concentrator System | Various | SC 110A |
References
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