Summary
Une caractéristique de la maladie d'Alzheimer est l'élévation de Aß
Abstract
Dépréciation des connexions synaptiques est susceptible de sous-tendent les changements subtils amnésique survenant dès les premiers stades de la maladie d'Alzheimer (MA). β-amyloïde (Aß), un peptide produit en grandes quantités dans la MA, est connue pour réduire potentialisation à long terme (LTP), un téléphone cellulaire corrélat de l'apprentissage et la mémoire. En effet, la dépréciation causée par Aßi LTP est un paradigme expérimental utile pour l'étude des dysfonctionnements synaptiques dans les modèles AD et pour le dépistage des drogues capables d'atténuer ou de revenir de telles déficiences synaptiques. Des études ont montré que Aßi produit la perturbation LTP préférentiellement via sa forme oligomérique. Ici, nous fournir un protocole détaillé pour la LTP compromettre par une perfusion de oligomérisés synthétiques Aβ1-42 peptide sur aigus coupes d'hippocampe. Dans cette vidéo, nous présentons une procédure étape par étape pour la préparation des oligomères Aßi
Protocol
Remise en suspension de β-amyloïde peptide
Avant de commencer avoir en main:
- Aßi 1-42 (poudre lyophilisée)
- 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)
- Basse-contraignante microtubes polypropylène (1,5 ml)
- Étanche seringue Hamilton avec arrêt plongent Téflon (250 pi)
- Diméthylsulfoxyde (DMSO)
- Autoriser Aßi lyophilisé 1-42 s'équilibrer à température ambiante pendant 30 minutes pour éviter la condensation à l'ouverture du flacon peptide.
- Sous la hotte, rétablir la suspension Aßi 1-42 peptide dans HFIP glacée pour obtenir une solution à 1 mM et tourbillons de la solution pendant quelques secondes.
- En utilisant un verre étanche seringue Hamilton avec bouchon en Teflon, rapidement diviser le Aßi 1-42 / HFIP solution aussi en trois flacons en polypropylène et sceller les flacons.
- Les flacons sont ensuite incubés pendant 2 heures pour permettre monomérisation Aß. Ensuite, ouvrez le flacon et concentrer la solution Aßi 1-42 / HFIP sous vide en utilisant une centrifugeuse SpeedVac (800 g, à température ambiante) jusqu'à un film peptide limpide sont observés au fond des flacons. Vérifiez soigneusement la température à l'intérieur de la centrifugeuse SpeedVac pour éviter la dégradation de peptides (max 25 ° C).
- Sceller le flacon et stocker les aliquots à -80 ° C. Film de Aß peuvent être stockées pendant 6 mois.
- Re-suspendre un film en ajoutant le DMSO pour obtenir une concentration de 5 mM Aßi 1-42. Soniquer dans le bain d'eau pendant 10 minutes pour assurer une complète remise en suspension.
- Aliquoter ce Aßi 5mM 1-42 solution dans des flacons en polypropylène. Sceller tous les flacons et les stocker à -20 ° C. Aliquotes doivent être décongelés qu'une seule fois. Attention à la condensation de l'eau à l'intérieur du congélateur. Peptides en solution se dégradent très facilement.
Oligomérisation
Avant de commencer avoir en main:
- Aßi 1-42 / DMSO (5mm)
- Tampon phosphate stérile
- Basse-contraignante microtubes polypropylène (1,5 ml)
- Basse-contraignante des tubes à centrifuger en polypropylène (50 ml)
- Diluer le Aßi obtenu 5mM 1-42 / DMSO aliquote avec un tampon phosphate stérile (jusqu'à 100 pi).
- Vortex pendant 30 secondes, puis incuber pendant 12 heures à 4 ° C
Traitement des tranches hippocampiques
Lors du traitement des coupes d'hippocampe, il est important d'éviter l'adhérence peptide non spécifique sur les béchers, les surfaces de tubes de perfusion, et la chambre d'enregistrement. Utilisez préférentiellement tube en polypropylène à faible contraignantes et des conteneurs. Eviter l'utilisation de la verrerie ou génériques en plastique-ware. Les médias perfusion devrait être de sérum ou de l'albumine libre.
Perfusion Aßi
Avant de commencer avoir en main:
- Aßi oligomérisés 1-42
- Mémoire tampon d'enregistrement (en mM: NaCl 124, KCl 4,4, 1 Na 2 HPO 4, 25 NaHCO 3, 2 CaCl 2, MgCl 2 2, et 10 de glucose)
- D'enregistrement électrophysiologiques set-up avec la chambre d'interface
- Transverse des coupes d'hippocampe incubés dans le tampon d'enregistrement oxygéné pendant au moins 90 minutes après la dissection (T = 29 ° C; vitesse de perfusion constante = 2 ml / minute)
- Immédiatement avant l'expérience, diluer l'Aß 1-42 oligomérisés aliquote à la concentration de travail appropriés (200 nM ou plus) dans un tube en polypropylène avec un tampon de pré-enregistrement oxygénée.
- Perfuser l'Aß 1-42 solution pendant 20 minutes pour les tranches avant l'induction d'une plasticité synaptique.
L'induction de la plasticité et de suivi
- Typiquement, le modèle le plus largement utilisé de la plasticité synaptique est la LTP. Elle peut être induite par la stimulation tétanique d'une synapse donnée dans l'hippocampe. Nous enregistrons les réponses de terrain à partir des synapses entre les projections de la garantie de Shaffer et CA1 neurones pyramidaux dans le stratum radiatum. Notre stimulation tétanique est constitué d'un éclatement de stimulation thêta qui comprend 3 trains séparés par des intervalles de 15 secondes. Chaque train est composé de 10 rafales à 5 Hz, où chaque rafale entraîne 5 impulsions à 100 Hz. Appliquer la stimulation tétanique immédiatement après la perfusion de Aßi oligomérisés a été achevé.
- Immédiatement après la stimulation tétanique revenir à la perfusion avec un tampon d'enregistrement normal. Maintenir un taux de perfusion constante, température de la chambre d'enregistrement et de l'oxygénation adéquate pendant toute la durée de l'expérience.
Les résultats représentatifs et les éventuels problèmes
L'Aßi oligomérisés selon le protocole classique de Stine et coll. 1, génère des monomères Aßi et une variété d'oligomères de taille différentes (dimère, trimère, etc) La perfusion de oligomérisés Aßi 1-42 conduit à la LTP a diminué dans Aßi-traités par rapport aux tranches les tranches de contrôle. Dans nos conditions expérimentales, où 3-5 mois vieilles souris C57BL/6J mâles sont utilisés, la LTP dans 200 nM Aßi-traitées tranches est en moyenne de 150% des valeurs de référence à deux heures après stimulation tétanique, alors que dans les tranches de contrôle des valeurs LTP sont en moyenne 200-250% du baseline2. Dans certains cas, le traitement par Aßi peuvent échouer à réduire les LTP hippocampique. Plusieurs erreurs critiques qui pourraient se produire notamment du film lors de la concentration excessive de séchage et de Aßi oligomérisation incomplète. Aßi perfusion de coupes d'hippocampe pourrait être une autre source de préoccupation en raison des propriétés physico-chimiques du peptide Aß dans la solution, qui est sujette à la non-adhérence spécifique aux matières plastiques. Dépannage de ces questions est traitée ci-dessous.
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Discussion
Comme décrit ci-dessus, plusieurs problèmes dans la préparation de Aßi oligomérique peut entraîner la LTP intacte. Une façon d'évaluer si la dégradation de l'Aß ou le manque d'oligomérisation Aßi a pu se produire est d'évaluer la préparation à l'aide Aßi TRIS-Tricine PAGE / Western blotting et l'analyse ultracentrifugation analytique (non décrite dans ce protocole). Lorsque occidentale échantillons Blotting sont préparés dans des conditions non-denaturing/non-reducing, une préparation réussie devrait générer une signature Western Blot avec des bandes correspondant aux monomères et des oligomères différente 3. Une question se produisant souvent est l'instabilité peptide pendant l'étape de séchage dans le concentrateur SpeedVac. En fait, séchage à haute température conduit à la dégradation des protéines, perceptible par la coloration de peptides marqués au brun. Concentration de la solution HFIP doit être effectuée à température ambiante et un suivi attentif. Compte tenu de la procédure en plusieurs étapes survenant dans le protocole, les erreurs de dilution peut accidentellement mener à oligomérisation pauvres ou de concentration Aßi trompeuse. Fait intéressant, la perfusion à des concentrations inférieures Aßi suggéré conduirait à des valeurs LTP a augmenté de 3. Encore une fois, la perfusion affecte les résultats possibles du traitement sur des tranches de Aß. En effet, maintenir une température constante de la solution de bain dans nos expériences électrophysiologiques est essentiel que la température est connue pour affecter les conformations Aßi lors résolu dans un tampon phosphate. Une autre source de préoccupation est que Aßi oligomères peuvent non spécifiquement coller aux surfaces en plastique des récipients et tubes utilisés pour la préparation et la perfusion réduisant ainsi la concentration effective exposés à des coupes d'hippocampe. Ainsi, il est essentiel d'utiliser à faible liaison aux protéines de plastique-ware pour assurer les préparatifs fiable et perfusions à travers différentes expériences. Dans ce numéro, nous vous proposons en plastique polypropylène-ware qui a été montré à ne pas affecter le ratio d'espèces différentes Aßi 4. Une littérature abondante suggère que la maladie d'Alzheimer est originaire comme un désordre synaptique 5. Il est probable que la subtilité et la variabilité des premiers symptômes amnésiques, survenant en l'absence de tout autre signe clinique d'une lésion cérébrale, sont dues à des changements discrets dans la fonction d'une seule synapse, produit au moins en partie, par des espèces de Aß ( ex Aßi 42 et Aßi 40) 2,6,7,8. La découverte que d'une préparation contenant oligomérisés Aßi synthétiques 1-42 peut nuire LTP 9 in vitro a conduit à de nombreuses enquêtes sur les mécanismes du dysfonctionnement synaptique induite par l'élévation Aß dans le cerveau. En utilisant ce protocole, nous décrivons une procédure pour la préparation de Aß oligomériques qui altère avec succès à la LTP Shaffer collatéraux de la strate connexion radiatum de coupes d'hippocampe. Ce paradigme expérimental a une valeur énorme pour enquêter sur les mécanismes de la pathogenèse Aßi médiation ainsi que les essais des médicaments potentiels, qui peuvent atténuer le dysfonctionnement synaptique 2,10,11.
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Disclosures
Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements stipulés par le IACUC l'Université Columbia.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le NIH Institut national des troubles neurologiques et des maladies (NINDS) (NS049442).>
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aβ 1-42 (lyophilized) | American Peptide | 62-0-80 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) | Fluka | 52517 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Biotium, Inc. | 90082 | |
| 50mL Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 05-538-67 | |
| 1.5ml MaxyClear microtubes Maximum recovery | Axygen Scientific | MCT-150-L-C | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| GASTIGHT Syringes 250 μL | Hamilton Co | 1725 | |
| Bath sonicator | Branson | 3510 | |
| Savant SpeedVac Concentrator System | Various | SC 110A |
References
- Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278, 11612-11622 (2003).
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