Summary
Мы сообщаем о развитии системы автоматизированного визуализации и анализа данио трансгенных эмбрионов в виде пластин многоямного. Это демонстрирует возможность измерения зависит от дозы эффект маленькая молекула, BCI, на фактор роста фибробластов экспрессии гена репортера и предоставлять технологию для создания высокой пропускной экраны данио химических веществ.
Abstract
Мы демонстрируем применение на основе образа высоким содержанием скрининга (ЖКХ) методологии для идентификации малых молекул, которые могут модулировать FGF / РАН / МАРК пути у эмбрионов данио. Данио эмбрион является идеальной системой для прижизненного высоким содержанием химических экранов. 1-дневного эмбриона составляет около 1 мм в диаметре и может быть легко одетые в 96-луночных планшетах, стандартный формат для высокопроизводительного скрининга. В первый день развития эмбриона являются прозрачными с большинством основных органов настоящее время, что позволяет визуализировать ткани образование во время эмбриогенеза. Полная автоматизация экраны данио вещество по-прежнему проблемой, однако, в частности, в разработке автоматизированных приобретение и анализа изображений. Мы ранее сгенерированный трансгенной линии репортеру, что выражает зеленый флуоресцентный белок (GFP) под контролем активности FGF и продемонстрировали свою полезность в химической экраны
Protocol
1) Настройка данио вязки и BCI лечения.
- За два дня до начала лечения, выявления гомозиготных мужчин Tg (dusp6: d2eGFP) PT6 данио и место индивидуально в брачный танков 1. Добавить разделитель и дикого типа AB * женский рыбу и оставить в клетках спаривания в одночасье.
- Следующим утром удалить сепаратор, и собирать эмбрионы через 1 час. Трансфер эмбрионов до 100мм блюда с E3 (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, CaCl2 0,33 мМ, 0,33 мМ MgSO 4), раствора и инкубировать при 28 ° С в течение 6 часов. Удалить мертвых и неоплодотворенные эмбрионы, добавить свежий раствор E3, и инкубировать в течение ночи.
- Сортировать трансгенных эмбрионов для подобных этапе (24hpf) и равномерное выражения GFP. Массив эмбрионов индивидуально в каждую лунку 96-луночного планшета.
- Удалите излишки раствора с E3 микропипетки. Добавить 200 мкл E3 решение с многоканальной пипетки в каждую лунку.
- Добавьте следующие соединения, как в списке:
Заключительные концентрации 1 мкм, 5 мкм, 10 мкм, 20 мкм, 25 мкм BCI в 1% ДМСО. Крышка в алюминиевую фольгу и выдержать в течение 6 часов при температуре 28 ° C.1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2μl
ДМСО2μl
BCl
(0,1 мм)2μl
BCl
(0,5 мм)2μl
BCl
(1 мм)2μl
BCl
(2 мм)2μl
BCl
(2,5 мм)2μl
BCl
(0,1 мм)2μl
BCl
(0,5 мм)2μl
BCl
(1 мм)2μl
BCl
(2 мм)2μl
BCl
(2,5 мм)2μl
ДМСОB 2μl
ДМСО2μl
BCl
(0,1 мм)2μl
BCl
(0,5 мм)2μl
BCl
(1 мм)2μl
BCl
(2 мм)2μl
BCl
(2,5 мм)2μl
BCl
(0,1 мм)2μl
BCl
(0,5 мм)2μl
BCl
(1 мм)2μl
BCl
(2 мм)2μl
BCl
(2,5 мм)2μl
ДМСОC 2μl
ДМСО2μl
BCl
(0,1 мм)2μl
BCl
(0,5 мм)2μl
BCl
(1 мм)2μl
BCl
(2 мм)2μl
BCl
(2,5 мм)2μl
BCl
(0,1 мм)2μl
BCl
(0,5 мм)2μl
BCl
(1 мм)2μl
BCl
(2 мм)2μl
BCl
(2,5 мм)2μl
ДМСОD 2μl
ДМСО2μl
BCl
(0,1 мм)2μl
BCl
(0,5 мм)2μl
BCl
(1 мм)2μl
BCl
(2 мм)2μl
BCl
(2,5 мм)2μl
BCl
(0,1 мм)2μl
BCl
(0,5 мм)2μl
BCl
(1 мм)2μl
BCl
(2 мм)2μl
BCl
(2,5 мм)2μl
ДМСОE 2μl
ДМСО2μl
BCl
(0,1 мм)2μl
BCl
(0,5 мм)2μl
BCl
(1 мм)2μl
BCl
(2 мм)2μl
BCl
(2,5 мм)2μl
BCl
(0,1 мм)2μl
BCl
(0,5 мм)2μl
BCl
(1 мм)2μl
BCl
(2 мм)2μl
BCl
(2,5 мм)2μl
ДМСОF 2μl
ДМСО2μl
BCl
(0,1 мм)2μl
BCl
(0,5 мм)2μl
BCl
(1 мм)2μl
BCl
(2 мм)2μl
BCl
(2,5 мм)2μl
BCl
(0,1 мм)2μl
BCl
(0,5 мм)2μl
BCl
(1 мм)2μl
BCl
(2 мм)2μl
BCl
(2,5 мм)2μl
ДМСОG 2μl
ДМСО2μl
BCl
(0,1 мм)2μl
BCl
(0,5 мм)2μl
BCl
(1 мм)2μl
BCl
(2 мм)2μl
BCl
(2,5 мм)2μl
BCl
(0,1 мм)2μl
BCl
(0,5 мм)2μl
BCl
(1 мм)2μl
BCl
(2 мм)2μl
BCl
(2,5 мМ)2μl
ДМСОH 2μl
ДМСО2μl
BCl
(0,1 мм)2μl
BCl
(0,5 мм)2μl
BCl
(1 мм)2μl
BCl
(2 мм)2μl
BCl
(2,5 мм)2μl
BCl
(0,1 мм)2μl
BCl
(0,5 мм)2μl
BCl
(1 мм)2μl
BCl
(2 мм)2μl
BCl
(2,5 мм)2μl
ДМСО
2) Автоматическая съемка 96-луночных планшетах и анализа.
- Добавить 10 мкл из tricaine (0.61mM) в каждую лунку, чтобы обезболить 30hpf эмбрионов.
- Нагрузка пластинки в Molecular Devices Imagexpress Ultra.
- Открытое Metaxpress программного обеспечения. Выбор конфигурации с 4-кратным объективных и максимальный диаметр отверстия, настроить лазер автофокусом обнаружить пластину снизу и определить оптимальные Z-плоскости для выявления областей, представляющих интерес. Получение изображений при возбуждении / излучение длиной волны 488/525 нм (GFP). Установить область сканирования как единый сайт 2000x2000 пикселей (4 х 4 мм) без биннинга. Настройка мощности лазера и получить такие яркие, что в регионах положительные образы контроля не насытить. Подтверждение надлежащего получения изображения в нескольких положительных и отрицательных скважин контроля.
- Начало пластины сканирования. Прибор автоматически получить изображения со всех лунок и архивировать их в базе данных сервера SQL.
- Загрузка изображений в Definiens разработчика с помощью модуля Cellenger применения и импорта фильтр, который распознает формат изображений и файлов структура, порожденная Molecular Devices платформы Imagexpress Ultra.
- Процесс изображения специально созданных Познание Сетевые технологии алгоритма (также называется набор правил). Алгоритм, который мы специально разработанных на основе недавно опубликованных правил 2, предназначен для автоматической идентификации эмбрионов, желток, и голову, и количественно яркости и области GFP-экспрессирующих структуры головы. Уэллс, в которых не обнаружено эмбриона или там, где голова не может быть однозначно назначена (например, с высокой токсичности соединения или не в фокусе изображения) исключены из анализа. Настройка алгоритма, используя несколько негативных образов управления (транспортное средство лечения), а также положительные образы контроля (BCI лечение) такие, что голова и желток правильно определены в обоих. Установить "голова структур" порог обнаружения, как кратные средняя интенсивность желтком до обнаружения ярких структур головы матчей визуального наблюдения. Определите параметры для экспорта. В данном примере наиболее информативным параметром была общая интегрированная яркость GFP-положительных регионов внутри головы, в дальнейшем называемый "общий напор структур яркость" (рис. 1).
Рисунок 1
График depicitng зависит от дозы эффект BCI на GFP экспрессии в трансгенных эмбрионах. - Выполнить алгоритм на все пластины изображения с помощью встроенного планировщика заданий. Программное обеспечение Definiens использует распределенные вычисления на нескольких процессорах ("двигателей"), что позволяет одновременного анализа нескольких изображений. Алгоритм рассчитывает численные меры, основанные на результатах анализа изображений, которые сохраняются в базе данных вместе с копией обработанное изображение, с анализом применения.
Представитель Результаты:
В конце концов изображения анализируются данные могут быть визуализированы в Cellenger или экспортировать в стороннее программное обеспечение (Excel, GraphPad Prism) для дальнейшего анализа и графического представления. На рисунке 2 показан архив сканировать изображения с транспортного средства, лечение и BCI-хорошо обращались, с и без CNT анализ применяется. На рисунке 1 документы дозозависимое влияние на BCI GFP репортер экспрессии генов в Tg (dusp6: d2EGFP) PT6 эмбрионов. Концентрация, необходимая для выявления половины максимального ответа (EC50) составляла примерно 12 мкм. 
Рисунок 2
Автоматизированная захвата и анализа изображений трансгенных эмбрионов данио. (А) ДМСО автомобиля рассматриваться Tg (dusp6: d2eGFP) PT6 эмбриона на 30hpf. (B), трансгенные эмбрионы рассматриваются с шоу-BCI 20 мкм увеличивается в выражении GFP. (C) Изображение эмбриона из () после запуска Definiens набор правил, чтобы найти GFP выражение в голову. Оранжевые пятна обозначают, где программное обеспечение мер GFP интенсивности. (D) Изображение эмбриона из (В) после запуска Definiens набор правил, чтобы найти GFP выражение в голову. Оранжевые пятна обозначают, где программное обеспечение мер GFP интенсивности. Обратите внимание, что набор правил был в состоянии найти расширенной зоне выражения GFP в обработанной эмбриона.
Discussion
Основным фактором, ограничивающим производительность экранов данио химических является отсутствие методологии систематического процесса 96-луночных планшетах для работы с изображениями и анализа. Потому что образы многоклеточные организмы являются сложными, низкий контраст и разнородные по своей природе, существующие алгоритмы анализа изображений не в состоянии обнаружить и количественно конкретных структур внутри организма. Часто публикуемые экраны данио химических поэтому включать визуальный осмотр отдельных скважин по выделенным персонала на всей процедуры. Как правило, это предотвращает поколения численных показаний и полное архивирование экранных изображений и данных. Кроме того, руководство оценки устраняет несколько ключевых преимуществ на основе образа скрининга, а именно способность провести ретроспективный анализ характеристик экрана, изучить фенотипические изменения, которые не были в центре внимания скрининга кампании (например, токсичность или пороки развития), а также крест ссылка отбора данных с прошлым или будущим экранов с помощью той же библиотеки соединения.
В данном отчете мы обращаем внимание методологии автоматизированного визуализации и анализа эмбрионов данио в виде пластин многоямного без вмешательства пользователя. Мы автоматизированного захвата изображения на лазерном ImageXpress Ультра сканирующей конфокальной читателя (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния), чтобы изображение Tg (dusp6: d2EGFP) PT6 эмбрионов в 96 луночных планшетах и разработан алгоритм анализа изображений на основе познания Definiens "Сетевые технологии, что количественно GFP выражение в головах трансгенных эмбрионов. Метод поставляются градуированные ответы и количественно в естественных условиях деятельности маленькая молекула активатора FGF сигнализации. Аналогичные результаты были получены с epifluorescence основе ArrayScan II (Cellomics Inc, Питтсбург PA) документирования, что это возможно реализовать автоматизированные захвата изображений из эмбрионов данио на различных коммерчески доступных читателям пластины 2. Разработка методологии для автоматического анализа изображений многоклеточного организма отпала необходимость визуального забив на человека-наблюдателя и позволило поколения и архивирование цифровых данных и изображений для ретроспективного анализа и сравнения с будущими экранов.
Acknowledgments
Эта работа финансируется за счет NICHD / NIH (1R01HD053287), чтобы Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039), чтобы Фогт, и NHLBI / NIH (1R01HL088016), чтобы Цанг.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (MS222) | Sigma-Aldrich | Cat.# A-5040 |
References
- Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).
- Vogt, A. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).
- Molina, G. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).
