Hjälp av ett automatiserat celltalsräknare att förenkla Studier Gene Expression: siRNA Knockdown av IL-4 beroende genuttryck i Namalwa Cells

Summary

Denna procedur beskriver ett snabbt och enkelt arbetsflöde för att införa siRNA in svårt att transfektera cellinjer och följa genuttrycket realtids-PCR. Användning av en automatiserad celltalsräknare, med flera bra elektroporation platta och automatiserad elektrofores stationen ger snabba och tillförlitliga resultat utan behov av dyra robotiserade hantering.

Abstract

Användningen av siRNA medierad gen ÖVERVÄLDIGANDE fortsätter att vara ett viktigt verktyg i studier av genuttryck. siRNA studier bedrivs inte bara för att studera effekterna av downregulating enstaka gener, men också för att förhöra signalvägar och andra komplexa nätverk interaktion. Dessa väg analyser kräver både användningen av relevanta cellulära modeller och metoder som orsakar mindre störningsräkning till cellulär fysiologi. Elektroporation används allt oftare som ett effektivt sätt att introducera siRNA och andra nukleinsyror i svåra att transfektera cellinjer och primära celler utan att ändra signalväg under utredning. Det finns flera viktiga steg för en framgångsrik siRNA experiment, och det finns sätt att förenkla arbetet och samtidigt förbättra kvaliteten på uppgifterna i flera experimentella stadier. För att hjälpa dig komma igång med din siRNA medierad gen ÖVERVÄLDIGANDE projektet kommer vi att visa hur du utför en väg studie komplett från att samla in och räkna cellerna innan elektroporation via post transfektion realtids-PCR genuttryck analys. Följande studie undersöker den roll som transkriptionell aktivator STAT6 i IL-4 beroende av genuttryck av CCL17 i en Burkitt lymfom cellinje (Namalwa). Det visade tekniker är användbara för ett brett spektrum av siRNA-baserade experiment på både anhängare och celler fjädring. Vi kommer också att visa hur man effektivisera cell räknar med TC10 automatiserade celltalsräknare, hur man electroporate flera prover samtidigt med MXcell elektroporation systemet, och hur man samtidigt bedöma RNA kvalitet och kvantitet med Experion automatiserade elektrofores system.

Protocol

1. Förbereda och räkna Namalwa cellerna

1. Ta bort celler från kultur-kolv och centrifugera celler till pellets. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i en känd volym av PBS. De celler som används i detta protokoll är fjädring celler. Om du använder anhängare celler som du behöver för att trypsinize innan insamlingen.
2. För att fastställa antalet levande celler, bets en alikvot av cellsuspensionen genom att blanda det 1:1 med en 0,4% trypan blå lösning och pipettera 10 ìl av blandningen på en räknar bild och sedan in bilden i TC10 automatiserade cellen räknare (Bio-Rad Laboratories, Inc).
3. Den TC10 celltalsräknare kommer autofokus att säkerställa den mest exakta räkna, och fortsätt sedan med att räkna. Den bestämmer automatiskt tätheten av levande celler och total celler i provet.
4. Välj Visa bild för att visa celler på viewscreen. Välj sedan utspädning räknaren för att få TC10 celltalsräknare automatiskt beräkna cellen blandning som kommer att behövas.
5. Detta experiment använder totalt tre siRNA: en kontroll siRNA och två olika siRNA riktade till STAT6 genen, plus untransfected kontroller. Detta kräver 3,6 ml till en slutlig koncentration av 5 X 10 ⁶ celler per ml.
6. Ange önskad koncentration och slutliga värden volym i den utspädning räknaren och den beräknar volymen av cellsuspensionen behövas baserat på levande celler för det provet. Alternativt kan utföra beräkningen manuellt. Sedan överföra erforderlig volym cell blandningen för dessa experiment i en ny tub.
7. Spin cellen blandningar till pellets cellerna och ta bort alla PBS. Resuspendera i 3,6 ml Gene Pulser elektroporation buffert (Bio-Rad Laboratories). Överför 800 l alikvoter i rör som innehåller lämplig siRNA och blanda försiktigt. Cellerna är nu redo för elektroporation.

2. Electroporating cellerna i 96-brunnars plattor

1. Den 96-bra elektroporation plattan låter replikerar för alla fyra behandlingar ska electroporated tillsammans.
2. Överför 150 l av cellsuspensionen i lämpliga brunnar i en 96-håls elektroporation plattan.
3. Sätt in plattan i MXcell elektroporering plattan kammare och stäng locket.
4. Electroporate med inställningarna optimerats för cellinje och buffert som används. Dessa celler är electroporated med en exponentiellt avtagande våg med instrumentets inställningar av 250 V, 350 uF och 1000 Ω motstånd.
5. Efter elektroporation är klar pipett upp och ner försiktigt i varje brunn för att mixa och sedan överföra celler till en vävnadskultur skylt som innehåller förvärmda media. Namalwa celler odlas i RPMI (Life Technologies) kompletterad med 7,5% FCS och 1% pyruvat.
6. Kontrollprover som inte har electroporated tas från de återstående cellsuspension och läggs till kultur rätter av förvärmda odlingsmedium identisk med electroporated cellerna.
7. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C med 5% CO _2.
8. Efter 24 tim, var en uppsättning celler induceras med 10 ng / ml slutkoncentration rekombinant IL-4 (FoU-system). Den andra typen av kontroll celler får endast ytterligare medier. Alla celler inkuberas ytterligare 24 tim vid 37 ° C och 5% CO _2.

3. Utdrag och kontrollera RNA

1. Efter sammanlagt 48 h om tillväxt, räkna cellerna i varje brunn, och överföra en alikvot från varje brunn till ett mikrofugrör för RNA-extraktion och frysa en andra alikvot för Western blotting eller andra proteinanalys.
2. Centrifugera prover till pellets cellerna och sedan ta bort och kasta supernatanten från varje rör.
3. Fortsätt med RNA-extraktion. Vi använder vanligtvis Aurum totala RNA-kit (Bio-Rad) enligt den medföljande protokollet.
4. Vid övervakning av siRNA medierad gen ÖVERVÄLDIGANDE är det särskilt viktigt att kontrollera RNA kvalitet eftersom försämras RNA kommer att ge missvisande resultat. Den 260/280 Förhållandet indikerar inte RNA integriteten därför är det viktigt att köra prover på en gel eller mikroflödessystem anordning för att bekräfta RNA är inte försämras.
5. För att bedöma både kvalitet och kvantitet i ett steg, kommer dessa prover analyseras med hjälp av Experion automatiserade elektrofores system (Bio-Rad).
6. Först, värme prover. Då, prime, belastning och Vortexa Experion RNA-chip. Sätt in marker i Experion elektrofores stationen och börja springa.
7. När körningen är klar kommer Experion programvaran visa resultaten automatiskt i form av en electropherogram, resultat bord (som visar RNA-koncentrationen, ribosomala förhållandet, och RNA kvalitetsindikator nummer), och virtuella gel (som liknar en traditionell RNA gel). Hög kvalitet totala RNA-prover har normalt en RQI på 8-10.

   4. Realtids-PCR

   1. Efter kontroll av de RNA kvalitet, fortsätt med cDNA reaktioner. Detta experiment använde iScript ett steg RT-PCR mix (Bio-Rad) att kombinera cDNA syntes och realtids-PCR på en reaktion.
   2. Gör en Master Mix innehåller alla reaktioner andra komponenter än RNA-mallar för varje primer uppsättning och distribuera dessa i PCR-plattan.
   3. Efter utspädning av RNA till en enhetlig koncentration, lägga till RNA-prov till lämpliga brunnar. Varje reaktion är inrättat i tre exemplar.
   4. Täta plattan och placera den i CFX384 realtids-PCR-system (Bio-Rad). Välj rätt protokoll och börja springa.
   5. När körningen är klar genuttryck bestäms genom att jämföra genuttrycket av genen av intresse normaliserat till en referensperiod genen i celler electroporated med experimentella siRNA till samma normalisering av celler electroporated med en kontrollgrupp siRNA.

   5. Analys av siRNA ÖVERVÄLDIGANDE

   1. Uttrycket av CCL17 övervakades med hjälp av kvantitativa realtids-PCR för att undersöka den roll som transkriptionell aktivator STAT6 i IL-4 beroende framkallande av CCL17. För detta experiment var GAPDH används som referens gen. Alternativ referens gener eller flera gener referens kan användas på samma sätt.
   2. Den CFX Manager normaliseras automatiskt CCL17 uttryck uttryck av referens gen från samma prov och automatiskt jämförs den resulterande normaliserade värden för att styra behandling genom att helt enkelt välja GAPDH som "referens" och styra behandlingen (kontroll siRNA utan IL-4 induktion) som "kontroll" i experimentet inställningsfönstret i CFX Manager.
   3. Utan IL-4 induktion, transkribering av CCL17 kvar på låga, konstitutiva nivåer jämförbara med kontrollen behandling.
   4. Celler inducerad med IL-4 och behålla en normal STAT6 vägen (dvs. kontroll siRNA eller untransfected behandlingar kontroll) visade 8-10 gånger induktion av CCL17 uttryck.
   5. Celler inducerad med IL-4 men med STAT6 uttryck hämmas av införandet av antingen STAT6 siRNA visade bara ca 2 gånger högre CCL17 uttryck än uninduced cellerna bekräftar roll STAT6 i IL-4 inducerad uttryck för CCL17.

   6. Representativa resultat

   
   Figur 1. Översikt över IL-4 signalväg.
   A) bindning av IL-4 till dess receptor leder till dimerization och aktivering av STAT6. Aktiverat STAT6 translocates till kärnan och aktiverar transkription av sitt mål gener, såsom CC17.
   B) Utan att IL-4 induktion, kommer transkribering av CCL17 kvar på låga, konstitutiva nivåer.
   C) Efter siRNA-medierad tysta de STAT6 gen bör behandling med IL4 leda till liten eller ingen ökning i CCL17 uttryck.

   
   Figur 2. Induktion av CCL17 genom IL4 mätt med andra villkor kvantitativa realtid PCR.
   A) Prov odlas utan IL-4 hade en låg konstitutiv nivå av uttryck oberoende av genuttryck.
   B) Som framgår av grönt och blått, svarade kontrollprov normalt att behandling med IL-4, med en 80-10 gånger induktion av CCL17. Men celler transfekterade med siRNA riktade STAT6, visas i rött och rosa, hade minskat CCL17 uttryck som svar på IL-4, som stöder tanken att STAT6 spelar en roll i IL-4 inducerad uttryck för CCL17.

Discussion

Den här artikeln har visat hur man electroporate siRNA in i ett svårt att transfektera linje fjädring cellen och hur man följa genuttryck i dessa celler. När du gör detta förfarande det är viktigt att komma ihåg att hålla saker så konsekvent som möjligt i alla prover.