L'utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull'espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

Summary

Questa procedura descrive un flusso di lavoro rapido e facile per introdurre siRNA difficile trasfezione in linee cellulari e seguire l'espressione genica mediante real-time PCR. L'utilizzo di un contatore di cellule automatizzati, multi-pozzetti elettroporazione, e la stazione di elettroforesi automatizzata fornire risultati rapidi e affidabili, senza bisogno di costosi movimentazione robotica.

Abstract

L'uso di knockdown gene mediato siRNA continua ad essere un importante strumento in studi di espressione genica. siRNA studi sono stati condotti non solo per studiare gli effetti di downregulating singoli geni, ma anche di interrogare vie di segnalazione e di altre reti di interazioni complesse. Queste analisi percorso richiedono sia l'utilizzo dei relativi modelli cellulari e metodi che causano meno perturbazione alla fisiologia cellulare. Elettroporazione viene sempre più usato come un modo efficace per introdurre siRNA e altri acidi nucleici in difficile trasfezione di linee cellulari e cellule primarie senza alterare la via di segnalazione sotto inchiesta. Ci sono diversi punti critici per un esperimento di siRNA di successo, e ci sono modi per semplificare il lavoro e di migliorare la qualità dei dati in diverse fasi sperimentali. Per aiutarvi a iniziare con il progetto mediato knockdown siRNA gene, dimostreremo come eseguire uno studio completo percorso di raccogliere e contare le cellule prima di elettroporazione attraverso trasfezione dopo analisi in tempo reale espressione genica PCR. Il seguente studio indaga il ruolo della attivatore trascrizionale STAT6 di IL-4 l'espressione genica dipendente di CCL17 in una linea cellulare di linfoma di Burkitt (Namalwa). Le tecniche sono dimostrate utili per una vasta gamma di siRNA a base di esperimenti sia aderente e cellule in sospensione. Mostreremo anche come semplificare il conteggio delle cellule con il contatore TC10 cellule automatizzate, come electroporate campioni contemporaneamente utilizzando il sistema di elettroporazione MXcell, e come valutare contemporaneamente la qualità e la quantità di RNA con il sistema automatico di elettroforesi Experion.

Protocol

1. Preparazione e contare le cellule Namalwa

1. Rimuovere le cellule dal fiasco della cultura e centrifugare le cellule a pellet. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in un volume noto di PBS. Le cellule utilizzate in questo protocollo sono cellule in sospensione. Se si utilizza cellule aderenti sarà necessario trypsinize prima del ritiro.
2. Per determinare il numero di cellule vive, macchia una aliquota di sospensione cellulare mescolandolo 1:1 con uno 0,4% soluzione trypan blu e seminare 10 microlitri della miscela su un vetrino di conteggio, e quindi inserire la diapositiva nella cella TC10 automatico contatore (Bio-Rad Laboratories, Inc.).
3. Il TC10 contatore di cellule sarà messa a fuoco automatica per garantire il conteggio più accurato, e quindi procedere con il conteggio. Si determina automaticamente la densità delle cellule vive e cellule totali nel campione.
4. Selezionare l'immagine da visualizzare le celle del viewscreen. Quindi selezionare la calcolatrice diluizione di avere il contatore TC10 cellula calcola automaticamente la quantità di miscela di cellule che saranno necessarie.
5. Questo esperimento sta utilizzando un totale di tre siRNA: un siRNA di controllo e di due diversi siRNA intese a promuovere l'STAT6 gene, oltre ai controlli untransfected. Ciò richiede 3,6 ml ad una concentrazione finale di 5 x 10 ⁶ cellule per ml.
6. Inserire la concentrazione desiderata e valori volume finale nella calcolatrice di diluizione, e si calcola il volume di sospensione cellulare necessari in base alla conta delle cellule vive per quel campione. In alternativa, eseguire il calcolo manualmente. Poi trasferire il volume di miscela di cellule per questi esperimenti in un tubo nuovo.
7. Gira la miscela di cellule per far sedimentare le cellule e rimuovere tutti i PBS. Risospendere nel 3,6 ml di tampone Gene elettroporazione Pulser (Bio-Rad Laboratories). Trasferire 800 microlitri aliquote in provette contenenti il ​​siRNA appropriato e mescolare delicatamente. Le cellule sono ora pronti per elettroporazione.

2. Electroporating le cellule in piastre da 96 pozzetti

1. Il 96-pozzetti elettroporazione consente la replica per tutti e quattro i trattamenti da elettroporate insieme.
2. Trasferire 150 ml di sospensione cellulare nei pozzetti appropriati di una piastra da 96 pozzetti elettroporazione.
3. Inserire la placca nella camera di elettroporazione MXcell piastra e chiudere il coperchio.
4. Electroporate utilizzando le impostazioni ottimizzate per la linea cellulare e del buffer utilizzato. Queste cellule sono elettroporate utilizzando un'onda decadimento esponenziale con le impostazioni dello strumento di 250 V, 350 uF, la resistenza e 1000 Ω.
5. Dopo l'elettroporazione è completa, pipetta su e giù delicatamente in ogni pozzetto di mescolare e poi trasferire le cellule a una piastra di coltura di tessuti contenenti pre-riscaldato media. Namalwa cellule sono coltivate in RPMI (Life Technologies) integrata con il 7,5% e 1% FCS piruvato.
6. I campioni di controllo che non sono stati elettroporate sono presi dalla sospensione cellulare residua e ha aggiunto ai piatti della cultura pre-riscaldato terreno di coltura in modo identico alle cellule elettroporate.
7. Cellule incubare una notte a 37 ° C con 5% di CO _2.
8. Dopo 24 ore, un insieme di cellule è stata indotta con 10 concentrazione ng / ml finale ricombinante IL-4 (R & D Systems). Il secondo gruppo di cellule di controllo solo ricevere supporto aggiuntivo. Tutte le cellule vengono incubate ulteriori 24 ore a 37 ° C e 5% di CO _2.

3. Estrarre e controllare l'RNA

1. Dopo un totale di 48 ore di crescita, contare le cellule di ogni bene, e trasferire una aliquota da ogni pozzetto in una provetta da microcentrifuga per l'estrazione di RNA, e di congelare una seconda aliquota per l'analisi delle proteine ​​western blotting o altro.
2. Centrifugare i campioni per agglomerare le cellule, e quindi rimuovere e scartare il surnatante da ogni provetta.
3. Procedere con l'estrazione di RNA. Noi in genere utilizzano il totale Aurum RNA kit (Bio-Rad) secondo il protocollo incluso.
4. Durante il monitoraggio knockdown gene mediato siRNA è particolarmente importante per verificare la qualità dell'RNA perché RNA degradato darà risultati fuorvianti. Il 260/280 rapporto non indica quindi l'integrità dell'RNA, è importante eseguire gli esempi su un gel o dispositivo a microfluidi per confermare l'RNA non sono degradati.
5. Per valutare sia la qualità e quantità in un unico passaggio, questi campioni saranno analizzati usando il sistema automatico di elettroforesi Experion (Bio-Rad).
6. In primo luogo, i campioni di calore. Quindi, primo, carico, e il chip vortice Experion RNA. Inserire il chip nella stazione di elettroforesi Experion e iniziare a correre.
7. Dopo la corsa è completa, il software Experion mostrerà automaticamente i risultati in forma di una tabella elettroferogramma, i risultati (che mostra la concentrazione RNA ribosomiale rapporto, e il numero di RNA indicatore di qualità), e gel virtuale (che è simile a un tradizionale RNA gel). Alta qualità dei campioni di RNA totale in genere hanno un RQI di 8-10.

   4. PCR in tempo reale

   1. Dopo aver verificato la qualità dell'RNA, procedere con le reazioni cDNA. Questo esperimento usato il one-step RT-PCR iScript mix (Bio-Rad) di combinare la sintesi del DNA e PCR in tempo reale in una reazione.
   2. Fai una master mix contenente tutte le componenti della reazione diversa i modelli di RNA per ogni set di primer, e distribuire tali nella piastra PCR.
   3. Dopo diluizione dello RNA ad una concentrazione uniforme, aggiungere i campioni di RNA nei rispettivi pozzetti. Ogni reazione è impostato in triplice copia.
   4. Sigillare la piastra, e il luogo in tempo reale CFX384 sistema PCR (Bio-Rad). Selezionare il protocollo appropriato e iniziare la corsa.
   5. Una volta che il percorso è completo, l'espressione genica è determinata confrontando l'espressione genica del gene di interesse normalizzato a un gene di riferimento nelle cellule elettroporate con siRNA sperimentale per la normalizzazione delle cellule stesse elettroporate con un controllo siRNA.

   5. Analisi dei knockdown siRNA

   1. L'espressione di CCL17 è stato monitorato utilizzando quantitativa real-time PCR per indagare il ruolo di attivatore trascrizionale STAT6 di IL-4 induzione dipendente di CCL17. Per questo esperimento, GAPDH è stato utilizzato come gene di riferimento. Geni di riferimento alternativo o più geni di riferimento può essere utilizzato nello stesso modo.
   2. Il software di gestione CFX automaticamente normalizzato CCL17 espressione di espressione del gene di riferimento dallo stesso campione e automaticamente confrontato i valori risultanti normalizzato per controllare trattamenti semplicemente selezionando GAPDH come "riferimento" e il trattamento di controllo (siRNA di controllo senza induzione di IL-4) come "controllo" nella finestra esperimento impostazioni del software di gestione CFX.
   3. Senza induzione di IL-4, la trascrizione di CCL17 rimasto a bassi livelli di costitutiva paragonabile al trattamento di controllo.
   4. Cellule indotte con IL-4 e mantenendo una normale STAT6 percorso (cioè, siRNA di controllo o di trattamenti di controllo untransfected) ha mostrato 8-10 volte l'induzione di CCL17 espressione.
   5. Cellule indotte con IL-4 ma con STAT6 espressione inibito dalla introduzione di entrambi i siRNA STAT6 mostrato espressione CCL17 solo di circa 2 volte maggiore rispetto alle cellule uninduced confermando il ruolo di STAT6 nelle IL-4 indotta l'espressione di CCL17.

   6. Rappresentante Risultati

   
   Figura 1. Panoramica del percorso IL-4 segnalazione.
   A) Il legame di IL-4 al suo recettore porta alla dimerizzazione e l'attivazione di STAT6. Attivato STAT6 trasloca al nucleo e attiva la trascrizione dei suoi geni bersaglio, come il CC17.
   B) Senza IL-4 induzione, la trascrizione di CCL17 rimarrà a bassi livelli costitutivi.
   C) Dopo siRNA-mediato silenziamento del gene STAT6, il trattamento con IL4 dovrebbe portare ad aumentare poco o niente in CCL17 espressione.

   
   Figura 2. L'induzione di CCL17 da IL4 misurata con diverse condizioni di tempo reale PCR quantitativa.
   A) I campioni coltivati ​​senza IL-4 aveva un basso livello costitutivo di espressione, indipendentemente dell'espressione genica.
   B) Come mostrato in verde e blu, campioni di controllo normalmente risposto al trattamento con IL-4, con una induzione 8-10 volte di CCL17. Tuttavia, le cellule trasfettate con siRNA targeting STAT6, mostrati in rosso e rosa, era diminuita CCL17 espressione in risposta a IL-4, supportando l'idea che STAT6 gioca un ruolo nella IL-4 indotta l'espressione di CCL17.

Discussion

Questo articolo ha dimostrato come electroporate siRNA in un difficile trasfezione di linee cellulari sospensione e come seguire l'espressione genica in queste cellule. Nel fare questa procedura s importante ricordarsi di mantenere le cose il più possibile coerenti in tutti i campioni.