Summary

Optische Scatter Microscopie op basis van twee-dimensionale Gabor filters

Published: June 02, 2010
doi:

Summary

We zien een donker veld microscopie op basis van Gabor-achtige filter om subcellulaire dynamiek maatregel binnen enkele levende cellen. De techniek is gevoelig voor veranderingen in de structuur van de organellen, zoals mitochondriën fragmentatie.

Abstract

Demonstreren we een instrument dat microscopisch kleine subcellulaire structuur die voortvloeien uit organel morfologie en de organisatie binnen onbesmet levende cellen kunnen meten. Het voorgestelde instrument breidt de gevoeligheid van de label-free optische microscopie op nanoschaal veranderingen in organel grootte en vorm en kan gebruikt worden om de studie van de structuur-functie relatie met betrekking tot organel dynamiek onderliggende fundamentele biologische processen, zoals de geprogrammeerde celdood of cellulaire versnellen differentiatie. De microscoop kan eenvoudig worden toegepast op de bestaande microscopie platforms, en kan dus worden verspreid aan de individuele laboratoria, waar wetenschappers kunnen implementeren en het gebruik maken van de voorgestelde methoden met onbeperkte toegang.

De voorgestelde techniek is in staat om subcellulaire structuur karakteriseren door het observeren van de cel door middel van twee-dimensionale optische Gabor filters. Deze filters kunnen worden afgestemd op gevoel met nanoschaal (10 van nm) gevoeligheid, specifieke morfologische kenmerken met betrekking tot de grootte en oriëntatie van niet-sferische subcellulaire organellen. Terwijl op basis van contrast gegenereerd door elastische verstrooiing, is de techniek niet op een gedetailleerd inverse verstrooiing model of op de Mie theorie morfometrische metingen te extraheren. Deze techniek is dus van toepassing op niet-bolvormige organellen die een nauwkeurige theoretische beschrijving scatter niet gemakkelijk gegeven, en biedt onderscheidende morfometrische parameters die kunnen worden verkregen binnen onbesmet levende cellen om hun functie te beoordelen. De techniek is voordelig in vergelijking met digitale beeldverwerking in die zin dat direct werkt op het veld van het object te transformeren in plaats van de intensiteit van de gediscretiseerde object. Het is niet afhankelijk van hoge beeld-sampling rates en kan dus worden gebruikt om de morfologische activity snel scherm binnen honderden cellen in een tijd, dus sterk de studie van de structuur organel vergemakkelijken dan individuele organel segmentatie en wederopbouw met behulp van fluorescentie confocale microscopie van de sterk vergrote digitale beelden van beperkte gezichtsveld.

In deze demonstratie laten we de gegevens van een mariene diatomeeën de methodiek illustreren. We laten ook zien voorlopige gegevens verzameld van levende cellen om een ​​idee van hoe de methode kan worden toegepast in een relevante biologische context te geven.

Protocol

1. Aan de cellen klaar De cellen die werden uitgeplaat op de dag voor moeten worden gemerkt met Mitotracker groen voor fluorescentie beeldvorming van de mitochondriën. Verwijder de 100 uM stockoplossing van Mitotracker groen in DMSO eerder gemaakte uit de 4 ° C vriezer, en op kamertemperatuur met de hand. Neem ook uit runderen aorta endotheelcellen (BAEC) celkweekmedium ook eerder bereid en warm tot 37 ° C in de stationaire waterbad. Zodra de Mitotracker en de cultuur medium worden opge…

Discussion

De hierboven beschreven methode levert morfometrische kaarten van het object dat deeltjesgrootte of oriëntatie voor bijvoorbeeld kunnen coderen. Deze structurele informatie kan worden gebruikt op verschillende manieren:

  1. Het kan gebruikt worden als een eerste scherm om weefsel of cel-regio's die zijn veranderd in een specifieke behandeling en dan verder deze regio's te analyseren met een specifieke moleculaire en biochemische assays te identificeren.
  2. Het kan worden gebruikt in combinatie m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De micro-mirror-apparaat in dit onderzoek werd gefinancierd door Whitaker Foundation subsidie ​​RG-02 tot 0.682 naar N. Boustany. Lopende werkzaamheden wordt gefinancierd door subsidie ​​NSF-DBI-0852857 naar N. Boustany. RM Pasternack werd gedeeltelijk ondersteund door een Rutgers presidentiële Graduate Fellowship. Wij zouden ook graag dr. E. White bedanken voor de iBMK cellen die in onze studies en dr. DN Metaxas voor nuttige discussie over optische filtering strategieën.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
DMEM   Invitrogen   Low glucose DMEM
Liebowitz L15 medium   Invitrogen   Without phenol red
L-glutamine   Invitrogen    
Mitotracker Green   Invitrogen    
Bovine Brain Extract   Clonetics    
Fetal Bovine Serum   Gemini Biosciences    
Heparin   Sigma    
Staurosporine   Sigma    
Dymethylsulfoxide   Sigma    
Inverted microscope   Carl Zeiss Axiovert 200M  
DMD   Texas Instruments TI 0.7 XGA DMD 1100  
CCD   Roper Scientific Cascase 512B High (16 bit) dynamic range CCD
CCD   Roped Scientific Coolsnap cf  

References

  1. Pasternack, R. M., Qian, Z., Zheng, J. -. Y., Metaxas, D. N., White, E., Boustany, N. N. Measurement of Subcellular Texture by Optical Gabor-Like Filtering with a Digitial Micromirror Device. Optics Letters. 33 (19), 2209-2211 (2008).
  2. Pasternack, R. M., Qian, Z., Zheng, J. -. Y., Metaxas, D. N., Boustany, N. N. Highly sensitive size discrimination of submicron objects using optical Fourier filtering based on two-dimensional Gabor filters. Optics Express. 17 (14), 12001-12012 (2009).
  3. Zheng, J. -. Y., Pasternack, R. M., Boustany, N. N. Optical scatter imaging with a digital micromirror device. Optics Express. 17 (22), 20401-20414 (2009).

Play Video

Cite This Article
Boustany, N. N., Pasternack, R. M., Zheng, J. Optical Scatter Microscopy Based on Two-Dimensional Gabor Filters. J. Vis. Exp. (40), e1915, doi:10.3791/1915 (2010).

View Video