Optische Scatter Microscopie op basis van twee-dimensionale Gabor filters
Summary
We zien een donker veld microscopie op basis van Gabor-achtige filter om subcellulaire dynamiek maatregel binnen enkele levende cellen. De techniek is gevoelig voor veranderingen in de structuur van de organellen, zoals mitochondriën fragmentatie.
Abstract
Demonstreren we een instrument dat microscopisch kleine subcellulaire structuur die voortvloeien uit organel morfologie en de organisatie binnen onbesmet levende cellen kunnen meten. Het voorgestelde instrument breidt de gevoeligheid van de label-free optische microscopie op nanoschaal veranderingen in organel grootte en vorm en kan gebruikt worden om de studie van de structuur-functie relatie met betrekking tot organel dynamiek onderliggende fundamentele biologische processen, zoals de geprogrammeerde celdood of cellulaire versnellen differentiatie. De microscoop kan eenvoudig worden toegepast op de bestaande microscopie platforms, en kan dus worden verspreid aan de individuele laboratoria, waar wetenschappers kunnen implementeren en het gebruik maken van de voorgestelde methoden met onbeperkte toegang.
De voorgestelde techniek is in staat om subcellulaire structuur karakteriseren door het observeren van de cel door middel van twee-dimensionale optische Gabor filters. Deze filters kunnen worden afgestemd op gevoel met nanoschaal (10 van nm) gevoeligheid, specifieke morfologische kenmerken met betrekking tot de grootte en oriëntatie van niet-sferische subcellulaire organellen. Terwijl op basis van contrast gegenereerd door elastische verstrooiing, is de techniek niet op een gedetailleerd inverse verstrooiing model of op de Mie theorie morfometrische metingen te extraheren. Deze techniek is dus van toepassing op niet-bolvormige organellen die een nauwkeurige theoretische beschrijving scatter niet gemakkelijk gegeven, en biedt onderscheidende morfometrische parameters die kunnen worden verkregen binnen onbesmet levende cellen om hun functie te beoordelen. De techniek is voordelig in vergelijking met digitale beeldverwerking in die zin dat direct werkt op het veld van het object te transformeren in plaats van de intensiteit van de gediscretiseerde object. Het is niet afhankelijk van hoge beeld-sampling rates en kan dus worden gebruikt om de morfologische activity snel scherm binnen honderden cellen in een tijd, dus sterk de studie van de structuur organel vergemakkelijken dan individuele organel segmentatie en wederopbouw met behulp van fluorescentie confocale microscopie van de sterk vergrote digitale beelden van beperkte gezichtsveld.
In deze demonstratie laten we de gegevens van een mariene diatomeeën de methodiek illustreren. We laten ook zien voorlopige gegevens verzameld van levende cellen om een idee van hoe de methode kan worden toegepast in een relevante biologische context te geven.
Protocol
Discussion
De hierboven beschreven methode levert morfometrische kaarten van het object dat deeltjesgrootte of oriëntatie voor bijvoorbeeld kunnen coderen. Deze structurele informatie kan worden gebruikt op verschillende manieren:
- Het kan gebruikt worden als een eerste scherm om weefsel of cel-regio's die zijn veranderd in een specifieke behandeling en dan verder deze regio's te analyseren met een specifieke moleculaire en biochemische assays te identificeren.
- Het kan worden gebruikt in combinatie m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De micro-mirror-apparaat in dit onderzoek werd gefinancierd door Whitaker Foundation subsidie RG-02 tot 0.682 naar N. Boustany. Lopende werkzaamheden wordt gefinancierd door subsidie NSF-DBI-0852857 naar N. Boustany. RM Pasternack werd gedeeltelijk ondersteund door een Rutgers presidentiële Graduate Fellowship. Wij zouden ook graag dr. E. White bedanken voor de iBMK cellen die in onze studies en dr. DN Metaxas voor nuttige discussie over optische filtering strategieën.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | Low glucose DMEM | ||
| Liebowitz L15 medium | Invitrogen | Without phenol red | ||
| L-glutamine | Invitrogen | |||
| Mitotracker Green | Invitrogen | |||
| Bovine Brain Extract | Clonetics | |||
| Fetal Bovine Serum | Gemini Biosciences | |||
| Heparin | Sigma | |||
| Staurosporine | Sigma | |||
| Dymethylsulfoxide | Sigma | |||
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200M | ||
| DMD | Texas Instruments | TI 0.7 XGA DMD 1100 | ||
| CCD | Roper Scientific | Cascase 512B | High (16 bit) dynamic range CCD | |
| CCD | Roped Scientific | Coolsnap cf |
References
- Pasternack, R. M., Qian, Z., Zheng, J. -. Y., Metaxas, D. N., White, E., Boustany, N. N. Measurement of Subcellular Texture by Optical Gabor-Like Filtering with a Digitial Micromirror Device. Optics Letters. 33 (19), 2209-2211 (2008).
- Pasternack, R. M., Qian, Z., Zheng, J. -. Y., Metaxas, D. N., Boustany, N. N. Highly sensitive size discrimination of submicron objects using optical Fourier filtering based on two-dimensional Gabor filters. Optics Express. 17 (14), 12001-12012 (2009).
- Zheng, J. -. Y., Pasternack, R. M., Boustany, N. N. Optical scatter imaging with a digital micromirror device. Optics Express. 17 (22), 20401-20414 (2009).
