Detección SDS-PAGE/Immunoblot de multímeros Aß en el tejido cortical humano homogeneizados utilizando antígeno de recuperación del epítopo
Summary
Se describe una técnica para la preparación de aclarar homogeneizados humanos cortical, la separación de proteínas por SDS-PAGE, la recuperación de antígeno y la inmunotransferencia con un anticuerpo para el péptido Aß. El uso de este protocolo, estamos constantemente detectar Aß monoméricos y multimérica en el tejido cortical de los seres humanos con la patología de Alzheimer.
Abstract
El plegamiento anómalo y la polimerización de la β-amiloide (Aß) péptido se cree que inician la cascada neurodegenerativa en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer<sup> 1</sup>. Aß es predominantemente un 40 – o 42 péptido ácido amino-que es propenso a la auto-agregación en hojas β-rica fibrillas amiloides que se encuentran en los núcleos de las placas seniles cerebrales en la enfermedad de Alzheimer. Evidencia creciente sugiere que bajo peso molecular, soluble multímeros Aß son más tóxicos que amiloide Aß fibrilar<sup> 2</sup>. La identificación y cuantificación de especies de bajo peso y alto peso molecular-Aß multimérica en el tejido cerebral es un objetivo esencial en la investigación de la enfermedad de Alzheimer, así como los métodos también pueden aplicarse a la identificación y caracterización de los multímeros tóxicos en proteopathies otros<sup> 3</sup>. De origen natural multímeros Aß pueden ser detectados por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS seguido por inmunotransferencia con Aß anticuerpos específicos. Sin embargo, la separación y detección de Aß multimérica requiere el uso de alta concentración homogeneizados corticales y la recuperación de antígenos en las membranas de nitrocelulosa pequeño tamaño de los poros. A continuación se describe una técnica para la preparación de aclarar homogeneizados corticales humanos, la separación de proteínas por SDS-PAGE, y el antígeno de recuperación del epítopo / borrar con 6E10 anticuerpos a la región N-terminal del péptido Aß occidental. El uso de este protocolo, estamos constantemente detectar monómeros Aß, dímeros, trímeros, tetrámeros y multímeros de alto peso molecular en el tejido cortical de los seres humanos con la patología de Alzheimer.
Protocol
Discussion
A pesar de la importancia de la agregación de Aß en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer 1,4,5, pocos estudios han descrito o cuantificar la distribución de los diversos multímeros Aß en muestras de tejido cortical 2. Comúnmente utilizado las técnicas de inmunohistoquímica no permiten la discriminación de las distintas especies de Aß multimérica en el tejido cortical fijo. En fijadas homogeneizados de tejido cortical, multímeros Aß se pueden separar y bioquímicamente evaluó …
Acknowledgements
Muchas gracias a Elaine Pranski y Carolyn Suwyn por su excelente asistencia técnica y Harry Levine III, M. Paul Murphy, y Transmisiones para conversaciones importantes Marla. El financiamiento fue proporcionado por el RR-00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, la Fundación Woodruff y la Universidad de Emory Comité de Investigación.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Santa Cruz Biotechnology | Sc-29130 | 1 tablet in 25ml buffer | |
| BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | ||
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark | Invitrogen | EI0002 | ||
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC1676 | ||
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Invitrogen | NP0004 | ||
| SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen | LC5925 | ||
| Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | EC6625BOX | ||
| Nitrocellulose membranes, 0.2 μm pore size | Invitrogen | LC2000 | ||
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Invitrogen | LC3675 | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | Will not interfere with immunostaining | |
| ATX Ponceau S Red staining solution | Sigma Aldrich | 09276 | Will not interfere with immunostaining | |
| Kapak heat sealable plastic sample pouches | Fisher Scientific | 0181225AA | ||
| 6E10 mouse monoclonal antibody to Aβ(1-16) | Covance | SIG-39320 | Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287 | ||
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (from sheep) | GE Healthcare Life Sciences | NA931-1ML | Dilute at 1:10,000 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | ThermoFisher | 34077 | ||
| Kodak Biomax MR Film | Carestream Health | 870 1302 |
References
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